[發明專利]一種金屬螯合親和色譜純化硫氧還蛋白的方法

在審

• 申請號: 201710685299.2
• 申請日: 2017-08-11
• 公開（公告）號: CN107267475A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 李大偉;周光大;林建華
• 申請（專利權）人: 浙江福斯特新材料研究院有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司33200
• 代理人: 邱啟旺

1.一種金屬螯合親和色譜純化硫氧還蛋白的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將硫氧還蛋白重組質粒(其基因序列如SEQ ID NO.1所示)置于大腸桿菌的細胞中，得菌液；在LB細胞培養液(含有卡那霉素25μg/mL和100μg/mL腺苷一磷酸，溶劑為水)中培養細胞(菌液與細胞培養液體積比為1：100)，使重組質粒表達完成，之后細胞經預冷到4℃的PBS溶液和室溫下的雙蒸水分別沖洗若干次，加入細胞裂解液，細胞裂解液的加入量與細胞培養液的體積比為1：1～1：20，搖動至溶液成透明狀，6000～16000r/min下離心5～60min，去除細胞碎片，分離上清液及菌沉淀，在上清液中加入用緩沖溶液平衡好的固定金屬離子的羧甲基天冬氨酸化的瓊脂糖凝膠微球，固定金屬離子的物質的量與細胞培養液的體積的比例為1：1～1：20(mol：mL)，孵育5～80min后，離心分離。

(2)在離心后余下的微球介質中采用淋洗液(含有NaCl的緩沖溶液)進行梯度淋洗，采用的梯度淋洗方法為：NaCl濃度在0mol/L到0.05mol/L范圍內以6mL/min的速度進行線性梯度洗脫)，淋洗之后再采用含有20～400mM咪唑的緩沖溶液進行充分洗脫，收集洗脫液，得到金屬螯合親和色譜純化硫氧還蛋白。

2.根據權利要求1所述的一種金屬螯合親和色譜純化硫氧還蛋白的方法，其特征在于：所述細胞經預冷到4℃的PBS溶液和室溫下的雙蒸水分別沖洗1～5次。

3.根據權利要求1所述的一種金屬螯合親和色譜純化硫氧還蛋白的方法，其特征在于：所述細胞裂解液和緩沖溶液組分相同，均含有0.1～200mM Tris-HCl、0.1～10mM EDTA、0.1～200mMNaCl、0.01％～10％(w/v)SDS，其余為無菌水。

4.根據權利要求1所述的一種金屬螯合親和色譜純化硫氧還蛋白的方法，其特征在于：所述細胞裂解液和緩沖溶液組分相同，均含有：0.1～200mM NaH₂PO₄、0.1～100mM Tris、0.1～100mMUrea，其余為無菌水。

5.根據權利要求1所述的一種金屬螯合親和色譜純化硫氧還蛋白的方法，其特征在于：所述離心步驟轉速優選為12000r/min，離心時間優選為10min。

6.根據權利要求1所述的一種金屬螯合親和色譜純化硫氧還蛋白的方法，其特征在于：所述固定金屬離子為具有d層空價電子軌道的過渡金屬離子，優選Co²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺。

7.根據權利要求1所述的一種金屬螯合親和色譜純化硫氧還蛋白的方法，其特征在于：所述咪唑的濃度優選為250mM。

8.根據權利要求1所述的一種金屬螯合親和色譜純化硫氧還蛋白的方法，其特征在于：所述步驟1和步驟2均在2～35℃的操作溫度范圍下進行。