[發明專利]檢測鏈特異性效率的成套試劑與方法

有效

• 申請號: 201710684356.5
• 申請日: 2017-08-11
• 公開（公告）號: CN109385468B
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發明（設計）人: 宗亮;伍梓靖;姚秋林;謝梅英
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C40B50/06;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

本發明公開了檢測鏈特異性效率的成套試劑與方法。本發明公開的檢測鏈特異性效率的成套試劑由SEQ ID NO:1?6所示的RNA組成，檢測鏈特異性效率的方法，包括：向待建庫的RNA中添加本發明的成套試劑，后進行鏈特異性轉錄組文庫構建，然后進行高通量測序，將測序數據與成套試劑的序列進行比對，計算成套試劑的正義比對讀段數目占成套試劑的總讀段數目的比例，該比例即為鏈特異性系數，根據鏈特異性系數確定鏈特異性效率。本發明的檢測鏈特異性效率的方法與成套試劑可以用于指示mRNA或非編碼RNA等鏈特異性轉錄組測序數據的可信程度，確保分析結果的可靠性。

技術領域

本發明涉及生物技術領域中，檢測鏈特異性效率的成套試劑與方法。

背景技術

隨著NGS(新一代測序技術)的蓬勃發展，轉錄組測序技術已成為研究基因表達的主要手段。轉錄組是連接基因組遺傳信息與生物功能的必然紐帶，是基因功能及結構研究的基礎和出發點。通過新一代高通量測序，能夠全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在特定狀態下的幾乎所有轉錄本序列信息，已廣泛應用于基礎研究、臨床診斷和藥物研發等領域。

但常規轉錄組在測序序列中不能提供鏈方向的特征信息，無法真實的反映轉錄情況。因此，鏈特異性轉錄組測序技術(ssRNA-Seq)應運而生。通過在構建測序文庫時，將mRNA鏈的方向信息保留，測序后的數據分析可確定轉錄本是來自正義還是反義DNA鏈。與普通轉錄組測序相比，它更能準確地統計轉錄本的數量和確定基因的結構，同時可以發現更多的反義轉錄本，目前被廣泛地應用于研究基因結構和基因表達調控等領域范圍。

目前有多種方法可以實現鏈特異性建庫，其中包括：RNA接頭連接法、末端模板轉換法、dUTP法等。據文獻報道，評估鏈特異性轉錄組建庫數據的常用方法為：明確實驗樣本的物種信息，并在互聯網數據庫中檢索其參考基因集，假定其所有基因都不存在反義表達現象，然后統計測序數據中來自反義鏈的讀段比例，并以此比例來評估鏈特異性轉錄組數據的質量。

現有的評估方案在應用中存在多種局限。首先，隨著轉錄組研究范圍的擴大，有大量實驗樣本其參考基因序列是不完整或可信度較低的，導致現有的評估方案無法進行。其次，假定其所有基因都不存在反義表達現象，是一種非常武斷的假設，不同物種、不同生理狀態下的樣本，必然存在不同程度的反義表達事件；而發現真實存在的反義表達事件，這也是鏈特異性轉錄組測序的實驗目標。再次，鏈特異性轉錄組建庫過程中所使用的反轉錄酶可能會有較強的DDDP(DNA-Dependent DNA Polymerase activities)活性及模版擴增步驟使用到PCR酶的差異等因素，都有可能會造成鏈特異性效率的下降，例如，深圳華大基因股份有限公司展開鏈特異性轉錄組測序研究，但RNA樣品鑒定到的定量結果與QPCR驗證實驗一致性較低，Pearson coefficient僅為0.542(附圖1)。最后，現有的評估方案需要在生物信息學流程中做額外一次反義比對的操作，需耗費較多的計算資源和時間。

高效率的鏈特異性處理，是確保轉錄本定量和基因結構優化結果準確的前提，但目前并不存在一種成熟的檢測方案，用于計算測序數據中鏈特異性處理的效率。這嚴重制約著鏈特異性轉錄組測序技術的應用和發展。

發明內容

本發明首先提供了檢測鏈特異性效率的成套試劑。

本發明所提供的成套試劑，為名稱分別為SCS1、SCS2、SCS3、SCS4、SCS5和SCS6的RNA中的至少一種；

所述SCS1為如下a1)至a4)中的任一種RNA：

a1)序列表中SEQ ID NO:1所示的RNA；

a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一個或幾個核苷酸得到的RNA；

a3)與a1)或a2)限定的RNA具有85％以上的同一性的RNA；

a4)在嚴格條件下與a1)或a2)限定的RNA雜交的RNA；