[發明專利]一種高靈敏檢測25羥基維生素D的時間分辨熒光免疫層析檢測試劑及其制備方法

在審

• 申請號: 201710683881.5
• 申請日: 2017-08-11
• 公開（公告）號: CN107656076A
• 公開（公告）日: 2018-02-02
• 發明（設計）人: 魏照征
• 申請（專利權）人: 普菲特益斯生物科技（北京）有限公司
• 主分類號: G01N33/82
• 分類號: G01N33/82;G01N33/558;G01N33/533;G01N33/543;G01N21/64
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司11212
• 代理人: 楊立,王灝增

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，具體地說，涉及一種高靈敏檢測25羥基維生素D的時間分辨熒光免疫層析檢測試劑及其制備方法。

背景技術

維生素D為一類脂溶性類固醇衍生物，分為維生素D2和維生素D3，在人體中，維生素D主要來源于陽光照射皮膚后合成，少部分從食物中攝入。合成的維生素D通過與維生素D結合蛋白結合而運輸到肝臟，而攝入的維生素D通過與脂蛋白結合轉運到肝臟。在肝臟內轉化成25-羥基維生素D。

維生素D缺乏在世界范圍內普遍存在，影響著30％～50％的人口。25-羥基維生素D是衡量維生素D營養狀態的最佳指標。

目前在國內市場上，已有的25-羥基維生素D檢測方法主要有酶聯免疫法和化學發光法，酶聯免疫法和化學發光法檢測25-羥基維生素D雖然線性范圍寬，靈敏度高，但反應時間長，檢測成本高，對檢測人員要求高，這些原因導致其在基層醫院難以推廣。普通熒光免疫層析法克服了以上困難，仍存在靈敏度低，成本高，不能滿足準確檢測的要求，因此，開發一種生產成本低、靈敏度高、特異性強，適合基層醫療機構使用的檢測試劑盒具有重要意義。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種生產成本低、靈敏度高、特異性強，適合基層醫療機構使用的檢測25羥基維生素D 的時間分辨熒光免疫層析檢測試劑及其制備方法。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：

本發明提供一種高靈敏檢測25羥基維生素D的時間分辨熒光免疫層析檢測試劑的制備方法，包括：

S1，熒光微球標記物制備：將雞IgY加入熒光微球中混合反應，形成熒光微球和雞IgY偶聯的標記物；在熒光微球中加入羊抗鼠IgG混合反應后，再加入鼠抗25羥基維生素D，形成熒光微球、羊抗鼠IgG和鼠抗25羥基維生素D的復合物偶聯的標記物；

S2,結合墊的制備：將熒光微球和雞IgY偶聯的標記物與熒光微球、羊抗鼠IgG和鼠抗25羥基維生素D的復合物偶聯的標記物混合得到混合熒光膠乳微粒，混合熒光膠乳微粒用微球稀釋液稀釋后噴涂在玻璃纖維上，干燥后形成結合墊；

S3,硝酸纖維素膜的制備：

將25羥基維生素D-BSA蛋白復合物用KPBS緩沖液稀釋并在在硝酸纖維素膜上劃線，干燥，制得檢測線；將兔抗雞IgY用KPBS緩沖液稀釋并在硝酸纖維素膜上劃線，干燥，制得質控線；

S4,樣品墊的制備：將玻璃纖維浸泡入樣品墊處理液中，待玻璃纖維完全浸透，取出后干燥；

S5,檢測卡組裝：將結合墊、吸水紙、樣品墊、硝酸纖維素膜和底板分別裁切至預設大小，撕掉底板上部紙膜，在底板上依次黏貼裁切好的硝酸纖維素膜、吸水紙、結合墊和樣品墊，得到檢測卡。

進一步，所述步驟S1中，所述熒光微球為經EDC/NHS活化的熒光微球；所述熒光微球與雞IgY的質量比為10：1～2；所述熒光微球與羊抗鼠IgG的質量比為10：1～2；所述熒光微球與鼠抗25羥基維生素D的質量比為20：0.5～1。

進一步，所述步驟S2中，熒光微球和雞IgY偶聯的標記物與熒光微球、羊抗鼠IgG和鼠抗25羥基維生素D的復合物偶聯的標記物的質量比為1:3～5；所述稀釋液的稀釋倍數為80～100倍；所述干燥溫度為37℃，干燥時間為3 小時。

進一步，所述步驟S3中，所述KPBS緩沖液的濃度為15mmol/L；稀釋后的25羥基維生素D-BSA蛋白復合物的濃度為0.5mg/ml，檢測線的溶液用量為1.0ul/cm；稀釋后的兔抗雞IgY溶液的濃度為1.0mg/ml，質控線的溶液量為1.0ul/cm。

進一步，所述步驟S3中，所述KPBS緩沖液的濃度為15mmol/L；干燥溫度：37℃，干燥時間：3小時。

進一步，所述步驟S4中，干燥溫度為37℃，干燥時間為3小時以上。

進一步，所述檢測試劑還包括檢測緩沖液，所述檢測緩沖液由以下方法的制備：將磷酸氫二鉀、二水合磷酸二氫鈉、氯化鈉、牛血清白蛋白和表面活性劑S9的溶液混合得到含有牛血清白蛋白和表面活性劑的緩沖液。

一種高靈敏檢測25羥基維生素D的時間分辨熒光免疫層析檢測試劑，包括檢測卡和與檢測卡配套使用的檢測緩沖液，