[發(fā)明專利]一種高靈敏檢測25羥基維生素D的時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測試劑及其制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710683881.5
• 申請(qǐng)日: 2017-08-11
• 公開（公告）號(hào): CN107656076A
• 公開（公告）日: 2018-02-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏照征
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 普菲特益斯生物科技（北京）有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/82
• 分類號(hào): G01N33/82;G01N33/558;G01N33/533;G01N33/543;G01N21/64
• 代理公司: 北京輕創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11212
• 代理人: 楊立,王灝增

1.一種高靈敏檢測25羥基維生素D的時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測試劑的制備方法，其特征在于，包括：

S1，熒光微球標(biāo)記物制備：將雞IgY加入熒光微球中混合反應(yīng)，形成熒光微球和雞IgY偶聯(lián)的標(biāo)記物；在熒光微球中加入羊抗鼠IgG混合反應(yīng)后，再加入鼠抗25羥基維生素D，形成熒光微球、羊抗鼠IgG和鼠抗25羥基維生素D的復(fù)合物偶聯(lián)的標(biāo)記物；

S2,結(jié)合墊的制備：將熒光微球和雞IgY偶聯(lián)的標(biāo)記物與熒光微球、羊抗鼠IgG和鼠抗25羥基維生素D的復(fù)合物偶聯(lián)的標(biāo)記物混合得到混合熒光膠乳微粒，混合熒光膠乳微粒用微球稀釋液稀釋后噴涂在玻璃纖維上，干燥后形成結(jié)合墊；

S3,硝酸纖維素膜的制備：

將25羥基維生素D-BSA蛋白復(fù)合物用KPBS緩沖液稀釋并在在硝酸纖維素膜上劃線，干燥，制得檢測線；將兔抗雞IgY用KPBS緩沖液稀釋并在硝酸纖維素膜上劃線，干燥，制得質(zhì)控線；

S4,樣品墊的制備：將玻璃纖維浸泡入樣品墊處理液中，待玻璃纖維完全浸透，取出后干燥；

S5,檢測卡組裝：將結(jié)合墊、吸水紙、樣品墊、硝酸纖維素膜和底板分別裁切至預(yù)設(shè)大小，在底板上依次黏貼裁切好的硝酸纖維素膜、吸水紙、結(jié)合墊和樣品墊，得到檢測卡。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高靈敏檢測25羥基維生素D的時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測試劑的制備方法，其特征在于，所述步驟S1中，所述熒光微球?yàn)榻?jīng)EDC/NHS活化的熒光微球；所述熒光微球與雞IgY的質(zhì)量比為10：1～2；所述熒光微球與羊抗鼠IgG的質(zhì)量比為10：1～2；所述熒光微球與鼠抗25羥基維生素D的質(zhì)量比為20：0.5～1。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高靈敏檢測25羥基維生素D的時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測試劑的制備方法，其特征在于，所述步驟S2中，熒光微球和雞IgY偶聯(lián)的標(biāo)記物與熒光微球、羊抗鼠IgG和鼠抗25羥基維生素D的復(fù)合物偶聯(lián)的標(biāo)記物的質(zhì)量比為1:3～5；所述微球稀釋液的稀釋倍數(shù)為80～100倍；所述干燥溫度為37℃，干燥時(shí)間為3小時(shí)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高靈敏檢測25羥基維生素D的時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測試劑的制備方法，其特征在于，所述步驟S3中，稀釋后的25羥基維生素D-BSA蛋白復(fù)合物的濃度為0.5mg/ml，檢測線的溶液用量為1.0ul/cm；稀釋后的兔抗雞IgY溶液的濃度為1.0mg/ml，質(zhì)控線的溶液量為1.0ul/cm。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高靈敏檢測25羥基維生素D的時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測試劑的制備方法，其特征在于，所述步驟S3中，所述KPBS緩沖液的濃度為15mmol/L；干燥溫度：37℃，干燥時(shí)間：3小時(shí)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高靈敏檢測25羥基維生素D的時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測試劑的制備方法，其特征在于，所述步驟S4中，干燥溫度為37℃，干燥時(shí)間為3小時(shí)以上。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的高靈敏檢測25羥基維生素D的時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測試劑的制備方法，其特征在于，所述檢測試劑還包括檢測緩沖液，所述檢測緩沖液由以下方法制備：將磷酸氫二鉀、二水合磷酸二氫鈉、氯化鈉、牛血清白蛋白和表面活性劑S9混合得到含有牛血清白蛋白和表面活性劑的緩沖液。

8.一種高靈敏檢測25羥基維生素D的時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測試劑，其特征在于，包括檢測卡和與檢測卡配套使用的檢測緩沖液，

所述檢測卡包括底板和依次黏貼在底板上的硝酸纖維素膜、吸水紙、結(jié)合墊和樣品墊；所述結(jié)合墊上噴涂有熒光微球和雞IgY偶聯(lián)標(biāo)記物與熒光微球、羊抗鼠IgG和鼠抗25羥基維生素D的復(fù)合物偶聯(lián)的標(biāo)記物混合得到混合熒光膠乳微粒；所述硝酸纖維素膜上設(shè)有含有25羥基維生素D-BSA蛋白復(fù)合物的檢測線和含有兔抗雞IgY的質(zhì)控線；

所述檢測緩沖液為包含牛血清白蛋白和表面活性劑的緩沖液。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的高靈敏檢測25羥基維生素D的時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測試劑，其特征在于，還包括與檢測卡一一對(duì)應(yīng)的ID卡，所述ID卡用于讀取產(chǎn)品校準(zhǔn)品的信號(hào)值、濃度、批號(hào)及單位信息。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的高靈敏檢測25羥基維生素D的時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測試劑，其特征在于，所述檢測緩沖液中的表面活性劑包括：磷酸氫二鉀、二水合磷酸二氫鈉、氯化鈉和表面活性劑S9。