[發明專利]一種高效提取甘蔗糖制品DNA的試劑盒和方法

有效

• 申請號: 201710679544.9
• 申請日: 2017-08-10
• 公開（公告）號: CN107267502B
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發明（設計）人: 曾巧英;凌秋平;齊永文;劉睿;吳嘉云;胡斐
• 申請（專利權）人: 廣東省科學院生物工程研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞

1.一種高效提取甘蔗糖制品DNA的方法，其特征在于：使用一種高效提取甘蔗糖制品DNA的試劑盒進行，包括如下步驟：

（1）預處理：將3～5 g甘蔗糖制品和10～20 mL預處理液混勻，于-20～-80 ℃處理至少24 h，第一次離心，收集沉淀；

（2）DNA的初步提取：在沉淀中加入500～1000 μL裂解液，混勻后于65～75 ℃，溫浴15～30 min；接著加入80～100 μL 濃度為10 M的NH4AC或濃度為3 M的KAC，冰上放置，第二次離心，取上清；接著在上清中加入等體積的DNA沉淀液進行沉淀，第三次離心，取沉淀；用濃度為70～75%（v/v）的乙醇清洗沉淀，加入100～200 μL水溶解DNA；

（3）DNA的純化：

①在步驟（2）最終得到的溶液中加入200～400 μL結合液和20～40 μL濃度為10 mg/mL的磁珠懸浮液，漩渦震蕩，置于磁力架上靜置，分離磁珠；

②在磁珠中加入漂洗液，漩渦混勻，置于磁力架上靜置，分離磁珠；

③在磁珠中加入濃度為75%（v/v）的乙醇，漩渦混勻，置于磁力架上靜置，分離磁珠；

④待磁珠干燥，乙醇揮發完全，加入洗脫液， 60～65 ℃ 溫浴10～15 min，分離磁珠，上清為純化得到的DNA；

所述的高效提取甘蔗糖制品DNA的試劑盒包括：預處理液、裂解液、DNA沉淀液、結合液、磁珠懸浮液；

其中，預處理液為10%～20%（w/v）的PEG8000；

裂解液的組成如下：300～800 mM NaCl、30～80 mM Tris-HCl、30～80 mM EDTA、2～4%（w/v）SDS，2～3%（w/v）PVPP或PVP，pH 8.0，溶劑為水；

DNA沉淀液為10%～30%（w/v）的PEG8000；

結合液的組成如下：10%～15%（w/v）的PEG8000、2～6 M GITC、30～60 mM NaCl、30～60mM Tris-HCl，pH6.4，溶劑為水。

2.根據權利要求1所述的高效提取甘蔗糖制品DNA的方法，其特征在于：

步驟（1）中所述的處理的時間為48 h；

步驟（1）中所述的第一次離心的條件為10000 rpm離心 30 min；

步驟（2）中所述的冰上放置的時間為10 min；

步驟（2）中所述的第二次離心的條件為4 ℃下12000 rpm離心10 min；

步驟（2）中所述的進行沉淀的時間為10 min；

步驟（2）中所述的第三次離心的條件為12000 rpm離心10 min；

步驟（3）①中所述的漩渦震蕩的時間為5 min；

步驟（3）①中所述的置于磁力架上靜置的時間為30 s；

步驟（3）②中所述的漂洗液的用量為400～800 μL；

步驟（3）②中所述的漩渦混勻的時間為1 min；

步驟（3）②中所述的置于磁力架上靜置的時間為30 s；

步驟（3）③中所述的乙醇的用量為500～1000 μL；

步驟（3）③中所述的漩渦混勻的時間為5 min；

步驟（3）③中所述的置于磁力架上靜置的時間為30 s；

步驟（3）④中所述的洗脫液的用量為30～50 μL。

3.根據權利要求1所述的高效提取甘蔗糖制品DNA的方法，其特征在于：

步驟（2）中所述的清洗沉淀的次數為1次；

步驟（3）③重復一次。

4.根據權利要求1所述的高效提取甘蔗糖制品DNA的方法，其特征在于：

所述高效提取甘蔗糖制品DNA的試劑盒還包括漂洗液和洗脫液；

所述的漂洗液的組成如下：50%（v/v）乙醇、0.2 M NaCl、10 mM EDTA、50 mM Tris-HCl、2 M GITC，pH7.6，溶劑為水；

所述的洗脫液的組成如下：10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH8.0，溶劑為水。