[發(fā)明專利]一種檢測水稻豇豆胰蛋白酶抑制劑的人工微球

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710676994.2
• 申請日: 2017-08-09
• 公開（公告）號: CN107449905A
• 公開（公告）日: 2017-12-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳剛;潘衛(wèi)東;華紅霞;王永模
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/545
• 代理公司: 武漢開元知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司42104
• 代理人: 朱盛華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于屬于生物檢測領(lǐng)域,具體涉及一種檢測水稻豇豆胰蛋白酶抑制劑的人工微球。

背景技術(shù)

蛋白酶抑制劑廣泛存在于植物體內(nèi)，尤其在植物的貯藏器官內(nèi)含量相當(dāng)高。在植物體內(nèi)蛋白酶抑制劑的生物學(xué)功能主要有兩個(gè)方面：①通過與內(nèi)源蛋白酶相互作用，調(diào)控組織細(xì)胞內(nèi)的有關(guān)生理生化過程；②防止細(xì)胞、組織內(nèi)的蛋白質(zhì)成分被外源蛋白酶所降解。其更重要的作用在于作為一種抵御外界植食性昆蟲和微生物攻擊的化學(xué)防衛(wèi)因子。研究證實(shí)，大多數(shù)植物來源的蛋白酶抑制劑對植物內(nèi)源性蛋白酶沒有抑制作用，但對外源蛋白酶有特異的抑制活性，這就為通過基因工程提高農(nóng)作物防衛(wèi)系統(tǒng)的效能提供了自然進(jìn)化上的基礎(chǔ)。

豇豆胰蛋白酶抑制劑(cowpea trypsin inhibitor，CpTI)屬絲氨酸蛋白酶抑制劑。與Bt毒蛋白相比，其殺蟲機(jī)理完全不同且具有殺蟲廣譜，對人畜安全，昆蟲不易產(chǎn)生抗性的優(yōu)點(diǎn)而受到人們的重視。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將CpTI基因?qū)胱魑锒@得的轉(zhuǎn)基因植株已在我國部分地區(qū)得到了大規(guī)模的應(yīng)用，但迄今對于轉(zhuǎn)基因植物中豇豆胰蛋白酶抑制劑的檢測方法不多，且檢測靈敏度、檢測限和抗干擾能力等亟待提高。目前，有關(guān)CpTI抑制劑檢測技術(shù)的研究報(bào)告和相關(guān)專利技術(shù)國內(nèi)外報(bào)道很少，迫切需要開發(fā)高效、準(zhǔn)確、快速的新型檢測技術(shù)和產(chǎn)品。

CN103160533B公開了一種特異性檢測轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號的標(biāo)準(zhǔn)分子及其應(yīng)用。所提供的標(biāo)準(zhǔn)分子為環(huán)狀載體，包括如序列1的第10-101位所示的豇豆胰蛋白酶抑制劑編碼基因片段、如序列1的第256-336位所示的蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白編碼基因片段、如序列1的第191-258位所示的水稻內(nèi)源基因GOS片段，以及如序列1的第108-184位所示的Ti質(zhì)粒T-DNA的邊界序列片段。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)狀，旨在提供一種取材簡單、操作方便；所制備的人工微球顆粒小，粒徑均勻，用于檢測CpTI蛋白靈敏度較高，且操作簡單、重復(fù)性強(qiáng)；檢測CpTI融合蛋白最低限為0.2μg/ml的檢測水稻豇豆胰蛋白酶抑制劑的人工微球。

本發(fā)明目的的實(shí)現(xiàn)方式為，一種檢測水稻豇豆胰蛋白酶抑制劑的人工微球，由抗CpTI蛋白多克隆抗體包被，微球顆粒大小200nm，表面載基團(tuán)為羧基；

檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的人工微球是由下述方法制備的，制備的具體步驟如下：

1)根據(jù)原核細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)先密碼子重新修飾并構(gòu)建全長CpTI基因表達(dá)序列；

2)構(gòu)建細(xì)菌融合表達(dá)載體pGEX-4T-2-CpTI，將CpTI基因片段通過限制酶切割插入谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因融合表達(dá)載體中；

所述構(gòu)建融合表達(dá)載體體pGEX-4T-2-CpTI是pGEX-4T-2-CpTI3；

3)對表達(dá)載體進(jìn)行細(xì)菌表達(dá)后，利用親合層析柱純化獲得GST-CpTI融合蛋白；

所述親合層析柱為Glutathione Sepharose 4B；

4)將佐劑溶合抗原后免疫小鼠，經(jīng)分離純化得到鼠抗CpTI多克隆抗體；

5)將步驟4)所得鼠抗CpTI多克隆抗體，通過羧基-氨基化學(xué)偶聯(lián)法偶聯(lián)活化微球，得到檢測CpTI蛋白的人工微球；

所述偶聯(lián)活化微球是首先用活化劑碳化二亞胺活化微球，然后加入保護(hù)劑Sulfo-NHS使微球形成穩(wěn)定的活潑酯中間體。

本發(fā)明采用單分散羧基化聚苯乙烯微球?yàn)榛|(zhì)材料，用化學(xué)偶聯(lián)方法偶聯(lián)抗CpTI多克隆抗體獲得，取材簡單、操作方便；制備方法細(xì)致嚴(yán)謹(jǐn)，重復(fù)性高；所制備的人工微球顆粒小，粒徑均勻，能檢測CpTI融合蛋白最低限0.2μg/ml，其相關(guān)系數(shù)R²＝0.67。

附圖說明

圖1A是羧基化聚苯乙烯化學(xué)結(jié)構(gòu)圖，

圖1B是羧基化聚苯乙烯微球掃描電鏡，

圖2是CpTI基因原序列全長圖譜，

圖3是以E.coli為表達(dá)宿主優(yōu)化后的CpTI基因序列圖譜，

圖4是菌落PCR驗(yàn)證CpTI基因插入片段電泳圖譜，

圖5是質(zhì)粒XbaⅠ酶切電泳圖譜，

圖6是CpTI表達(dá)載體測序圖譜，

圖7A、B是GST-CpTI融合蛋白做SDS-PAGE、Western Blotting分析圖譜，

圖8是抗血清效價(jià)測定圖，

圖9是人工增強(qiáng)比濁法檢測CpTI融合蛋白結(jié)果圖，

圖10A是CpTI融合樣品圖，

圖10B是CpTI融合樣品比色分析圖，