[發明專利]一種檢測水稻豇豆胰蛋白酶抑制劑的人工微球

在審

• 申請號: 201710676994.2
• 申請日: 2017-08-09
• 公開（公告）號: CN107449905A
• 公開（公告）日: 2017-12-08
• 發明（設計）人: 吳剛;潘衛東;華紅霞;王永模
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/545
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司42104
• 代理人: 朱盛華

技術領域

本發明屬于屬于生物檢測領域,具體涉及一種檢測水稻豇豆胰蛋白酶抑制劑的人工微球。

背景技術

蛋白酶抑制劑廣泛存在于植物體內，尤其在植物的貯藏器官內含量相當高。在植物體內蛋白酶抑制劑的生物學功能主要有兩個方面：①通過與內源蛋白酶相互作用，調控組織細胞內的有關生理生化過程；②防止細胞、組織內的蛋白質成分被外源蛋白酶所降解。其更重要的作用在于作為一種抵御外界植食性昆蟲和微生物攻擊的化學防衛因子。研究證實，大多數植物來源的蛋白酶抑制劑對植物內源性蛋白酶沒有抑制作用，但對外源蛋白酶有特異的抑制活性，這就為通過基因工程提高農作物防衛系統的效能提供了自然進化上的基礎。

豇豆胰蛋白酶抑制劑(cowpea trypsin inhibitor，CpTI)屬絲氨酸蛋白酶抑制劑。與Bt毒蛋白相比，其殺蟲機理完全不同且具有殺蟲廣譜，對人畜安全，昆蟲不易產生抗性的優點而受到人們的重視。通過轉基因技術將CpTI基因導入作物而獲得的轉基因植株已在我國部分地區得到了大規模的應用，但迄今對于轉基因植物中豇豆胰蛋白酶抑制劑的檢測方法不多，且檢測靈敏度、檢測限和抗干擾能力等亟待提高。目前，有關CpTI抑制劑檢測技術的研究報告和相關專利技術國內外報道很少，迫切需要開發高效、準確、快速的新型檢測技術和產品。

CN103160533B公開了一種特異性檢測轉基因水稻品系科豐6號的標準分子及其應用。所提供的標準分子為環狀載體，包括如序列1的第10-101位所示的豇豆胰蛋白酶抑制劑編碼基因片段、如序列1的第256-336位所示的蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白編碼基因片段、如序列1的第191-258位所示的水稻內源基因GOS片段，以及如序列1的第108-184位所示的Ti質粒T-DNA的邊界序列片段。

發明內容

本發明的目的是針對上述現狀，旨在提供一種取材簡單、操作方便；所制備的人工微球顆粒小，粒徑均勻，用于檢測CpTI蛋白靈敏度較高，且操作簡單、重復性強；檢測CpTI融合蛋白最低限為0.2μg/ml的檢測水稻豇豆胰蛋白酶抑制劑的人工微球。

本發明目的的實現方式為，一種檢測水稻豇豆胰蛋白酶抑制劑的人工微球，由抗CpTI蛋白多克隆抗體包被，微球顆粒大小200nm，表面載基團為羧基；

檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的人工微球是由下述方法制備的，制備的具體步驟如下：

1)根據原核細胞表達的優先密碼子重新修飾并構建全長CpTI基因表達序列；

2)構建細菌融合表達載體pGEX-4T-2-CpTI，將CpTI基因片段通過限制酶切割插入谷胱甘肽-S-轉移酶基因融合表達載體中；

所述構建融合表達載體體pGEX-4T-2-CpTI是pGEX-4T-2-CpTI3；

3)對表達載體進行細菌表達后，利用親合層析柱純化獲得GST-CpTI融合蛋白；

所述親合層析柱為Glutathione Sepharose 4B；

4)將佐劑溶合抗原后免疫小鼠，經分離純化得到鼠抗CpTI多克隆抗體；

5)將步驟4)所得鼠抗CpTI多克隆抗體，通過羧基-氨基化學偶聯法偶聯活化微球，得到檢測CpTI蛋白的人工微球；

所述偶聯活化微球是首先用活化劑碳化二亞胺活化微球，然后加入保護劑Sulfo-NHS使微球形成穩定的活潑酯中間體。

本發明采用單分散羧基化聚苯乙烯微球為基質材料，用化學偶聯方法偶聯抗CpTI多克隆抗體獲得，取材簡單、操作方便；制備方法細致嚴謹，重復性高；所制備的人工微球顆粒小，粒徑均勻，能檢測CpTI融合蛋白最低限0.2μg/ml，其相關系數R²＝0.67。

附圖說明

圖1A是羧基化聚苯乙烯化學結構圖，

圖1B是羧基化聚苯乙烯微球掃描電鏡，

圖2是CpTI基因原序列全長圖譜，

圖3是以E.coli為表達宿主優化后的CpTI基因序列圖譜，

圖4是菌落PCR驗證CpTI基因插入片段電泳圖譜，

圖5是質粒XbaⅠ酶切電泳圖譜，

圖6是CpTI表達載體測序圖譜，

圖7A、B是GST-CpTI融合蛋白做SDS-PAGE、Western Blotting分析圖譜，

圖8是抗血清效價測定圖，

圖9是人工增強比濁法檢測CpTI融合蛋白結果圖，

圖10A是CpTI融合樣品圖，

圖10B是CpTI融合樣品比色分析圖，