[發(fā)明專利]一種檢測水稻豇豆胰蛋白酶抑制劑的人工微球

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• 申請日: 2017-08-09
• 公開（公告）號: CN107449905A
• 公開（公告）日: 2017-12-08
• 發(fā)明（設計）人: 吳剛;潘衛(wèi)東;華紅霞;王永模
• 申請（專利權）人: 華中農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/545
• 代理公司: 武漢開元知識產(chǎn)權代理有限公司42104
• 代理人: 朱盛華

1.一種檢測水稻豇豆胰蛋白酶抑制劑的人工微球，其特征在于：由抗CpTI蛋白多克隆抗體包被，微球顆粒大小200nm，表面載基團為羧基；

檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的人工微球是由下述方法制備的，制備的具體步驟如下：

1)根據(jù)原核細胞表達的優(yōu)先密碼子重新修飾并構建全長CpTI基因表達序列；

2)構建細菌融合表達載體pGEX-4T-2-CpTI，將CpTI基因片段通過限制酶切割插入谷胱甘肽-S-轉移酶基因融合表達載體中；

所述構建融合表達載體體pGEX-4T-2-CpTI是pGEX-4T-2-CpTI3；

3)對表達載體進行細菌表達后，利用親合層析柱純化獲得GST-CpTI融合蛋白；

所述親合層析柱為Glutathione Sepharose 4B；

4)將佐劑溶合抗原后免疫小鼠，經(jīng)分離純化得到鼠抗CpTI多克隆抗體；

5)將步驟4)所得鼠抗CpTI多克隆抗體，通過羧基-氨基化學偶聯(lián)法偶聯(lián)活化微球，得到檢測CpTI蛋白的人工微球；

所述偶聯(lián)活化微球是首先用活化劑碳化二亞胺活化微球，然后加入保護劑Sulfo-NHS使微球形成穩(wěn)定的活潑酯中間體。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測水稻豇豆胰蛋白酶抑制劑的人工微球，其特征在于：步驟1)構建全長CpTI基因表達序列的具體步驟如下：

①設計全長CpTI基因序列；

②根據(jù)原核細胞表達的優(yōu)先密碼子重新修飾，采用全基因合成技術構建全長CpTI基因，共333對堿基，克隆至載體pGEM-T Easy；

③通過菌落PCR驗證CpTI基因片斷插入的正確性；

④將克隆CpTI基因菌實施擴增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進行酶切和瓊脂糖電泳分析；

⑤DNA測序，保證基因的全部序列100％準確。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測水稻豇豆胰蛋白酶抑制劑的人工微球，其特征在于：步驟2)所述谷胱甘肽-S-轉移酶基因融合表達載體是pGEX-4T-2，構建完成后的融合表達載體是pGEX-4T-2-CpTI3對表達載體進行細菌表達后，利用親合層析柱純化獲得GST-CpTI融合蛋白。

4.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測水稻豇豆胰蛋白酶抑制劑的人工微球，其特征在于：步驟2)對表達載體進行細菌表達的步驟是：

①將融合表達載體pGEX-4T-2-CpTI轉化大腸桿菌BL21(DE3)細胞，細胞生長條件為230轉/分，溫度37℃；

②當菌體生長OD₅₉₅值為0.5-0.8時，加入1.0mM的誘導劑IPTG，在25℃誘導3小時；在4℃時，以5,000×g離心5分鐘，收集菌體；

③菌體經(jīng)PBS緩沖液清洗3次后，超聲破碎，破碎細胞在4℃時，以14,000×g離心1小時，收集上清液。

5.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測水稻豇豆胰蛋白酶抑制劑的人工微球，其特征在于：步驟3)中將步驟2)收集的上清液循環(huán)通過Glutathione Sepharose 4B親合層析柱，4℃過夜，未結合蛋白用10倍床體積的1×PBS沖洗；結合的GST-CpTI融合蛋白用洗脫液洗脫并收集、保存。

6.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測水稻豇豆胰蛋白酶抑制劑的人工微球，其特征在于：步驟4)的具體步驟是：

①將GST-CpTI融合蛋白抗原與弗氏佐劑混合后，充分乳化，采用背部多點注射法BALB/c小鼠；每次的抗原量約10μg，三次，每次兩周后經(jīng)尾動脈取血檢測抗體效價；

②以適宜濃度的抗原包被酶標板，100μl/孔，4℃過夜；

③用0.1M，pH＝7.4的磷酸緩沖液洗滌后，加入待檢的血清樣品，100μl/孔，37℃1小時；設陰性對照孔；

④用0.1M，pH＝7.4的磷酸緩沖液洗滌后，加入HRP標記的羊抗鼠IgG的抗體試劑，100μl/孔，37℃避光顯色15分鐘；用2M H₂SO₄終止反應后，閱讀各孔的A490值；。

⑤對制備的抗GST-CpTI融合蛋白抗體，經(jīng)ELISA法檢測，抗體能與GST-CpTI，GST蛋白特異性結合，測特異性結合相關系數(shù)。

7.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測水稻豇豆胰蛋白酶抑制劑的人工微球，其特征在于：步驟5)通過羧基-氨基化學偶聯(lián)法偶聯(lián)活化微球的制備和檢測步驟如下：

①將單分散羧基化聚苯乙烯微球用活化劑碳化二亞胺活化，然后加入保護劑Sulfo-NHS，使檢測CpTI蛋白的人工微球形成穩(wěn)定的活潑酯中間體；

②在活潑酯中間體中加入抗CpTI蛋白多克隆抗體，溫育1-2小時；

③用0.1M，pH＝7.4的磷酸緩沖液洗滌后，收集檢測CpTI蛋白的人工微球；

④通過CA-1680型生化分析儀，采用人工增強比濁法，檢測CpTI融合蛋白樣品；

⑤經(jīng)生化分析儀檢測，用于檢測CpTI蛋白的人工微球最低檢測限為CpTI融合蛋白0.2μg/ml，其相關系數(shù)R²＝0.67。