[發明專利]基于馬泰勒蟲裂殖子表面蛋白1的間接ELISA檢測試劑盒制備方法

在審

• 申請號: 201710676779.2
• 申請日: 2017-08-09
• 公開（公告）號: CN108627649A
• 公開（公告）日: 2018-10-09
• 發明（設計）人: 巴音查汗·蓋力克;張楊;郭慶勇;宋瑞其;劉世芳;李永暢;王盼舉;聞秀秀;謝小婉;張夢圓
• 申請（專利權）人: 新疆農業大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 烏魯木齊新科聯知識產權代理有限公司 65107
• 代理人: 祁磊

本發明為基于馬泰勒蟲裂殖子表面蛋白1的間接ELISA檢測試劑盒制備方法，包括馬泰勒蟲EMA1蛋白的制備與馬泰勒蟲病rELISA檢測方法的建立。本發明解決常規檢測試劑盒昂貴、特異性差、耗時等缺點，建立馬泰勒蟲病rELISA檢測方法，適用于馬泰勒蟲病的臨床診斷和流行病學監測。

技術領域

本發明涉及基因重組技術，針對馬泰勒蟲EMA1基因的克隆、表達與制備及rELISA抗體檢測試劑盒的構建，特別是基于馬泰勒蟲裂殖子表面蛋白1的間接ELISA檢測試劑盒制備方法。

背景技術

馬泰勒蟲病是由馬泰勒蟲引起的蜱傳血液原蟲病。該病主要感染馬屬動物(馬，騾，驢和斑馬)，呈急性，亞急性或慢性等。通常呈發燒，貧血，黃疸，肝脾腫大，血管內溶血，可視黏膜黃染及血紅蛋白尿等表征，但慢性感染時臨床癥狀不明顯；患病馬匹即使后期治愈后也會終身帶蟲，作為傳染源傳播給其它馬屬動物；該病廣泛分布在熱帶和亞熱帶地區，據聯合國糧食和農業組織的數據顯示，2013年世界范圍內馬匹存欄量約為1.12億匹，其中全球大約90％的馬屬動物分布在馬泰勒病流行地區。近年來，多個國家有馬泰勒蟲病的報道，如韓國、蒙古、委內瑞拉、突尼斯、蘇丹、意大利、匈牙利、沙特阿拉伯、墨西哥及美國德克薩斯等，對馬產業造成重大經濟損失；在國際馬術競技比賽中馬泰勒病作為重要的檢測項目之一。馬泰勒病的防控為保持健康良好的國際性馬產業市場至關重要。

目前，對馬泰勒蟲病診斷方法大致可分為病原體顯微鏡檢測方法、分子生物學技術診斷方法和血清學診斷方法。基層疫病監測部門對該病的診斷仍停留在傳統的鏡檢法，且受到制片與染色技術等多種因素的影響，易造成漏診和誤診，特別是相似形態蟲體的鑒別診斷以及大規模的流行病學調查較為困難。近年來，馬泰勒蟲診斷技術逐步創新，從最早的顯微鏡觀察蟲體到現在的應用分子生物學手段檢測馬泰勒蟲。D.P.Knowles等(1991)已報道馬感染馬泰勒蟲后的血清抗體能與裂殖子表面抗原蛋白(EMA)發生特異性反應。且EMA極具保守性；而后重組的馬泰勒蟲裂殖子蛋白(EMA-1)被證實可在大腸桿菌和利用桿狀病毒在昆蟲細胞中表達；Salim等用EMA-2和Bc48的重組蛋白作為檢測馬梨形蟲的ELISA包被抗原，通過對158匹份馬血清樣品進行馬泰勒蟲和駑巴貝斯蟲抗體檢測，也證實利用表達的重組抗原建立的ELISA檢測方法的可靠性；Cristiane Divan Baldani等用EMA-1基因在大腸桿菌克隆并表達出34kDaHis6-EMA1蛋白，純化重組His6-EMA1蛋白構建ELISA檢測方法，并對巴西東南部的圣保羅現場采集的170份血清樣品進行檢測，馬泰勒蟲的陽性率為95.88％ (163/170)。

盡管國外對于馬泰勒蟲病EMA1蛋白的研究較成熟，仍存在價格高昂、針對性較差等劣勢。而在國內，尚缺少一種可針對馬泰勒蟲病地方病原進行檢測的一種高效、快速的血清學檢測試劑盒。基于此，本試劑盒可填補國內尚缺少一種能高效、快速、靈敏的檢測馬泰勒蟲病的ELISA檢測試劑盒這一空缺。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于馬泰勒蟲裂殖子表面蛋白1的間接ELISA檢測試劑盒制備方法，制備高效、特異性強的馬泰勒蟲裂殖子表面蛋白用于ELISA診斷，解決常規檢測試劑盒昂貴、特異性差、耗時等缺點，建立馬泰勒蟲病rELISA檢測方法，適用于馬泰勒蟲病的臨床診斷和流行病學監測。