[發明專利]用于流感疫苗生產的MDCK細胞株

有效

• 申請號: 201710676196.X
• 申請日: 2017-08-09
• 公開（公告）號: CN107603942B
• 公開（公告）日: 2021-01-01
• 發明（設計）人: 楊曉明;黃曉媛;張家友;劉洋;趙巍;施金榮;王英;韓錫鑫
• 申請（專利權）人: 武漢生物制品研究所有限責任公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N7/00;A61K39/145;A61P31/16
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 唐寧

1.一株MDCK亞克隆細胞株MDCK-G1，所述的細胞株保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:C201773。

2.權利要求1所述的MDCK-G1細胞株在制備流感病毒疫苗中的應用，其特征在于，所述的流感病毒為H5N1病毒。

3.根據權利要求2所述的應用，所述的疫苗為滅活疫苗。

4.權利要求1所述的MDCK-G1細胞株的大規模培養方法，其特征在于，所述方法的參數如下：

（1）培養基為MEM培養基添加5%~10%小牛血清，pH 6.8～7.5；

（2）攪拌速度40～70rpm；

（3）微載體濃度3～8g/L，接種密度10cells/微載體；

（4）葡萄糖濃度6-12mmol/L。

5.權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的培養參數還包括，培養反應器為7.5L灌流反應器。

6.以權利要求1所述的MDCK-G1細胞株為載體，生產流感病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟：

（1）培養所述MDCK-G1細胞株；

（2）對步驟（1）培養獲得的細胞接種流感病毒；

（3）放大培養接種后的細胞，收獲病毒液并對病毒液進行純化；

所述的流感病毒為H5N1流感病毒，所述的疫苗為滅活疫苗。

7.以權利要求1所述的MDCK-G1細胞株為載體，生產H5N1流感病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的方法步驟如下：

（1）在所述的MDCK-G1細胞密度為1.0×10⁶cells/ml～3.0×10⁶cells/ml時，以MOI0.00001～0.001接種H5N1流感病毒；

（2）接種后更換細胞培養液為病毒培養液，培養至HA滴度平臺期，收獲病毒液；

（3）對病毒液進行微濾、除菌過濾；

（4）對病毒液進行滅活，濃縮和純化。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的細胞密度為1.5×10⁶cells/ml，所述的接種MOI為 0.0001。

9.根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于，

步驟（3）所述的微濾為使用3μm濾網過濾，除菌過濾使用0.22μm過濾器；

步驟（4）所述的滅活為使用甲醛滅活；

步驟（4）所述的濃縮為超濾濃縮；

步驟（4）所述的純化為采用層析法純化。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，

步驟（4）所述的滅活為采用終濃度100μg/mL的甲醛，2～8℃滅活144h；

步驟（4）所述的濃縮為采用300kD膜包超濾濃縮；

步驟（4）所述的純化為采用Sepharose 4 FF凝膠進行層析純化。