[發明專利]一種重組雞長效干擾素α及制備此長效干擾素的融合蛋白及其制備方法

在審

• 申請號: 201710676016.8
• 申請日: 2017-08-09
• 公開（公告）號: CN107286252A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 趙俊;符修樂;夏兵兵;徐慕珍;程正陽;徐文俊;單雪芹;郭志燕
• 申請（專利權）人: 蕪湖英特菲爾生物制品產業研究院有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;A61P31/12;A61P37/04;C12R1/19
• 代理公司: 蕪湖安匯知識產權代理有限公司34107
• 代理人: 任晨晨

技術領域

本發明屬于生物基因工程技術領域，具體涉及一種重組雞長效干擾素α及制備此長效干擾素的融合蛋白及其制備方法。

背景技術

近年來，隨著養殖業的規模化和畜禽及其產品流通業迅速的發展，我國家禽業取得長足發展，形成了年產值逾千億元的巨大產業。然而由于我國薄弱的動物防疫體系，禽病仍然是我國家禽生產面臨的嚴重問題，這已經成為制約我國禽類養殖業發展的重要因素。禽病多、損失大，死亡率高于15％，死淘率達20％～25％(發達國家不足5％)，我國養雞業每年由于傳染病所導致的雞只死亡數量約為3億只，直接造成的經濟損失約30億元，造成的間接損失約100億元。

目前對于雞病毒性疾病的預防和治療主要采用的是疫苗免疫和藥物治療，由于疫苗免疫的血清型單一，病毒血清型眾多且病毒毒株變異速度快，從而經常導致疫苗免疫失敗。盡管一些抗生素和化學合成的抗病毒藥物對少數病毒有一些作用，但由于藥物殘留經食物鏈給人類健康帶來負面影響，我國從16年開始明令禁止一些抗生素和抗菌劑在養殖業中的應用。因此，積極研制生產無毒副作用、無藥物殘留和不產生耐藥性的干擾素制劑，對目前雞病毒性疾病預防和治療困境有著重要的臨床意義。

IFN是一類病毒感染誘導機體產生具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和具有免疫調節作用的蛋白質，1957年Issacs和Lindeman首先發現，它是一類多功能的細胞因子，與細胞受體結合后，可誘導機體產生多種特異性蛋白質和酶類，主要通過抑制病毒基因轉錄和降解病毒RNA來抑制病毒的生長繁殖以及發揮抗腫瘤等的活性。按照IFN的產生細胞、生化特征及在機體免疫方面所發揮作用的不同，分為α、β、γ三類。現已知，α型IFN在體內可有選擇性地作用于病毒等感染細胞，通過抑制受染細胞內的病毒蛋白質的生物合成，發揮廣譜和高效抗病毒作用。IFN-α主要生物學活性為具有抑制病毒復制、抗寄生蟲、抑制多種細胞增殖、刺激免疫細胞的殺傷活性。

γ型IFN是由激活的T細胞和NK細胞產生，具有較強抗病毒和免疫調節功能。大量研究表明，干擾素γ除了具有廣譜抗病毒功能外，對免疫系統也起著關鍵的調節作用，所以IFN-γ又稱為免疫調節干擾素。雖然各種類型的干擾素均能夠介導細胞對病毒感染的反應，但干擾素γ的免疫調節活性在協調免疫反應和確定機體長期的抗病毒狀態中發揮更為重要的作用，因此干擾素γ具有極為重要的臨床應用價值。

天然干擾素及人工重組干擾素目前普遍存在半衰期短的局限，半衰期一般為2-4個小時。半衰期短給治療帶來了極大的不便，治療次數的增加，相應的時間成本及經濟成本隨之增加，而機體的耐受極限也有可能被突破導致不良反應的產生。半衰期短的主要原因有兩個：干擾素的分子量過小在體內代謝過快，干擾素尤其是重組干擾素親和力較差被免疫系統清除。

而市面上常見的長效干擾素以聚乙二醇融合干擾素為代表，僅在分子量的層面上部分解決了干擾素分子量小而導致半衰期短的問題，同時聚乙二醇融合干擾素成本非常高，不利于在家禽臨床上應用。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了一種重組雞長效干擾素α及制備此長效干擾素的融合蛋白及其制備方法，所述重組雞長效干擾素可顯著提高雞干擾素的半衰期，較普通雞干擾素的半衰期提高13倍以上，并具有廣譜抗病毒作用并能提高雞自身的免疫應答。

本發明采取的技術方案為：

一種由雞干擾素γ與雞干擾素α組成的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示。

本發明還提供了編碼上述融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示，記為基因組1；或如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示，記為基因組2。

所述基因組1和所述基因組2均可編碼所述融合蛋白。基因組2是對基因組1的核苷酸序列進行優化之后的結果，通常密碼子適應指數CAI＝1.0時被認為該基因在該表達系統中為最優的高效表達狀態，CAI值越低表明在宿主中表達水平越低。基因中GC含量最理想分布范圍為30～70％，在任何區域內超過該范圍均會影響翻譯和轉錄效率。利用軟件檢測發現雞IFN-γ和IFN-α原始基因的密碼子在大腸桿菌中密碼子適應指數(CAI)分別為0.25、0.31，GC百分比為42.9％、61.7％；而通過對雞IFN-γ和IFN-α基因優化后得到重組基因在大腸桿菌中密碼子適應指數(CAI)為1.0、1.0，GC百分比47.6％、58.5％。通過基因優化顯著降低了低密碼子的使用率，避免了稀有密碼子對蛋白表達的影響，改善了基因的GC含量，提高了轉錄翻譯效率。