[發明專利]用于檢測RhD mRNA剪接體的PCR引物組合、試劑盒及實時熒光定量檢測方法

有效

• 申請號: 201710674747.9
• 申請日: 2017-08-09
• 公開（公告）號: CN107254543B
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發明（設計）人: 梁延連;唐雄馳;張印則;吳凡;徐慶萍
• 申請（專利權）人: 深圳市血液中心
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 深圳市康弘知識產權代理有限公司 44247
• 代理人: 尹彥;胡朝陽

本發明公開了一種用于檢測RhD mRNA剪接體實時熒光定量PCR引物組合、試劑盒及檢測方法，屬于生物檢測技術領域。本發明針對RhD mRNA剪接體序列設計實時熒光定量PCR引物組合，該引物的特異性強，不受其他非目的基因干擾，能快速、高效、準確地對RhD mRNA剪接體進行定量。本發明應用實時熒光定量PCR方法對RhD mRNA剪接體進行定量檢測，方法簡單、精確，無管道內污染，無需凝膠電泳，此方法可以準確定量不同個體RhD mRNA剪接體的拷貝數。結果重現性好，檢測靈敏度高，特異性強，可用于高通量的樣品檢測。

技術領域

本發明涉及一種用于檢測RhD mRNA剪接體的PCR引物組合，同時還涉及包含該引物組合的試劑盒及RhD mRNA剪接體實時熒光定量檢測方法，屬于生物檢測技術領域。

背景技術

RH基因的復雜性直接體現在RhD抗原表達的多態性，這被認為是不僅與RhD mRNA水平上的異質性有關還與相關基因外顯子的缺失、數量表達等相關。同時Le Van Kim等還發現：RHCE基因存在選擇性剪接而形成不同形式的基因轉錄產物 [1]，同樣的有研究者發現在正常的D抗原陽性的個體中存在第7外顯子至第9外顯子的多種復雜的選擇性剪接[2]，該剪接體的多態性決定RHD基因表達D抗原的特性。血型基因的遺傳背景有明顯的種族間差異，是因為不同人種的RhD mRNA基因出現選擇性多樣剪接出現RhD亞型所造成[3]。mRNA即messenger RNA信使 RNA是由DNA經由轉錄而來，帶著相應的遺傳訊息，為下一步轉譯成蛋白質提供所需的訊息。基于RHD基因的多態性，本文建立實時熒光定量的方法對不同個體的RhD mRNA剪接體檢測，通過監測RhD mRNA表達的多態性了解不同個體RHD 基因的差異。實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR)/QRT-PCR，是指在 PCR反應體系中加入熒光標記物，利用熒光信號的積累實時監測整個PCR過程，通過擴增曲線對未知模板進行定量分析的方法。

[1]LE VAN K C,MOURO I,CHERIF-ZAHAR B,et al.Molecular cloning andprimary structure of the human blood group RhD polypeptideProe Natl.Acad SeiUSA,1992,89(22):10925-10929.

[2]邵超鵬，熊文,等.替代剪切形成多種形式的RhD mRNA.中國輸血雜志，2004，17(5)：310-314.

[3]LE VAN K C，CHERIF-ZAHAR B，RAYNAL V，et al.Multiple Rh messenger RNAisoforms are produced by alternative splicing.Blood,1992,80(4):1074-1078.

發明內容

為了克服現有技術中存在的缺點和不足，本發明的目的在于提供一種檢測RhDmRNA剪接體的PCR引物組合、試劑盒及實時熒光定量PCR檢測方法。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種用于檢測RhD mRNA剪接體的PCR引物組合，包括以下三對引物的至少一對：

(1)用于擴增全長RhD mRNA剪接體的1對共2條引物，2條引物的序列分別為：

上游引物：5'-CCCACAGCTCCATCATGGG-3'(SEQ ID NO:1)，

下游引物：5'-GCCAATCATGCCATTGCCGGC-3'(SEQ ID NO:2)；

(2)用于擴增缺失exon-7的RhD mRNA剪接體的1對共2條引物，2條引物的序列分別為：

上游引物：5'-TGGCTGGGCTGATCTCCG-3'(SEQ ID NO:3)