[發(fā)明專利]用于檢測RhD mRNA剪接體的PCR引物組合、試劑盒及實(shí)時熒光定量檢測方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201710674747.9 | 申請日： | 2017-08-09 |
| 公開（公告）號： | CN107254543B | 公開（公告）日： | 2020-11-10 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 梁延連;唐雄馳;張印則;吳凡;徐慶萍 | 申請（專利權(quán)）人： | 深圳市血液中心 |
| 主分類號： | C12Q1/6851 | 分類號： | C12Q1/6851;C12N15/11 |
| 代理公司： | 深圳市康弘知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44247 | 代理人： | 尹彥;胡朝陽 |
| 地址： | 518000 廣東*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 用于 檢測 rhd mrna 剪接 pcr 引物 組合 試劑盒 實(shí)時 熒光 定量 方法 | ||
1.一種用于非診斷和非治療目的的檢測RhD mRNA剪接體的實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：
（1）配制12個不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，相鄰濃度之間的梯度為1個數(shù)量級，即濃度相差10倍；
（2）配制PCR反應(yīng)液：
PCR級H2O 8.5μL
5pmol/L引物組合物 0.5μL
Master Mix 10μL
標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品cDNA樣本 1μL
其中，所述引物組合物包括以下三對引物：
（a）用于擴(kuò)增全長RhD mRNA剪接體的1 對共2條引物，2條引物的序列分別如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示，
（b）用于擴(kuò)增缺失exon-7的RhD mRNA剪接體的1 對共2條引物，2條引物的序列分別如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，
（c）用于擴(kuò)增缺失exon-7,8,9的RhD mRNA剪接體的1 對共2條引物，2條引物的序列分別如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；
（3）PCR擴(kuò)增：將上述PCR反應(yīng)液與不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品分別混合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 預(yù)變性10min；96℃變性10s，60℃ 復(fù)性3s，72℃ 延伸3秒，循環(huán)35次，72℃ 再延伸10s；
（4）利用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品得到的數(shù)據(jù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；
（5）利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣品的濃度，
其中，所述步驟（1）中，所述標(biāo)準(zhǔn)品為SEQ ID NO:7-9所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測RhD mRNA剪接體的實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，所述步驟（5）中，所述計(jì)算是利用2nd Derivative Max計(jì)算法進(jìn)行的。
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