[發(fā)明專利]一種從外周血中高效高純度擴增自然殺傷細胞的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710673718.0
• 申請日: 2017-08-09
• 公開（公告）號: CN107326008B
• 公開（公告）日: 2019-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李新峰;周雁冰;汪佳瑩
• 申請（專利權(quán)）人: 上海萊馥醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 上海泰能知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 31233
• 代理人: 黃志達;魏峯

本發(fā)明涉及一種從外周血中高效高純度擴增自然殺傷細胞的方法，包括：采集100～200ml的外周血，分離單個核細胞，把單個核細胞放入被CD16單抗和CD226單抗包被過的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，同時用IFN?γ激活細胞；激活24小時以后，培養(yǎng)基中加入IL?2、IL?15、IL?21、OK432、CD2單抗和滅活的自體血清；隨后把細胞轉(zhuǎn)移到?jīng)]有被CD16單抗和CD226單抗包被過的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每2?3天給細胞補液一次；最后把細胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋中培養(yǎng)，第21天收集NK細胞即可。本發(fā)明不使用任何異源血清成分和滋養(yǎng)層細胞，從而確保了所制得NK細胞的安全性和可靠性，具有良好的臨床應(yīng)用價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細胞分化和培養(yǎng)領(lǐng)域，特別涉及到一種從外周血中高效高純度擴增自然殺傷細胞的方法。

背景技術(shù)

自然殺傷細胞(natural killer，NK)是機體重要的先天免疫細胞，由骨髓造血干細胞分化而來，其發(fā)育和成熟依賴于骨髓或胸腺微環(huán)境；成熟NK細胞主要分布于外周血和脾臟，在淋巴結(jié)和其他組織中也有少量存在。NK細胞較大，含有胞漿顆粒，故稱大顆粒淋巴細胞，因為不表達特異性抗原識別受體，所以NK是不同于T、B淋巴細胞的第三類淋巴細胞。NK細胞表達CD56和CD16，但是缺失CD3，通常用標志物組合CD3^-CD56⁺來鑒定NK細胞。

NK細胞在無需抗原預(yù)先致敏的情況下就能直接殺傷腫瘤細胞和被感染的細胞，而且也不受MHC分子的限制，無需抗體參與。NK細胞可以通過多種方式殺傷靶細胞：1、與靶細胞接觸后，NK細胞通過釋放穿孔素和顆粒酶殺傷靶細胞；2、通過自身表達的配體，來激活靶細胞表面的死亡受體；3、通過抗體依賴性細胞介導(dǎo)的毒性作用(ADCC)對靶細胞造成殺傷；4、活化的NK細胞通過釋放TNF引發(fā)靶細胞的細胞凋亡。

NK細胞是人體的第一道抵御防線，可以清除腫瘤細胞、被病毒感染的細胞、異體移植的組織或者細胞。NK細胞可以用于腫瘤免疫治療領(lǐng)域，因為NK細胞具有以下優(yōu)點：1.有光譜的抗腫瘤能力，無需抗原預(yù)先致敏能直接殺傷腫瘤細胞。2.能夠快速和大量的清除腫瘤細胞。3.無毒副作用，能提高患者的生存質(zhì)量。外周血淋巴細胞中NK細胞的比例只有15％左右，數(shù)量非常有限，所以這限制了NK細胞的臨床應(yīng)用。當今獲得臨床級NK細胞的方法是體外培養(yǎng)，多數(shù)情況下是從患者的外周血中大量誘導(dǎo)和擴增NK細胞，使其數(shù)量增加數(shù)百倍甚至數(shù)千倍，再把NK細胞回輸?shù)交颊叩捏w內(nèi)，但是常規(guī)的NK細胞的制備方法需要改進。NK細胞體外難以擴增，常見的NK細胞的擴增方法包括先用免疫磁珠分選NK細胞然后再培養(yǎng)(SieglerU,et al.,Cytotherapy 12(6):750-63,2010)、滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)法(Fujisaki H,et al.,Cancer Res 69(9):4010-7,2009)和使用動物血清(Iliopoulou EG,et al.,CancerImmunol Immunother 59(12):1781-9,2010)。動物血清能提供細胞培養(yǎng)所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，還能提供激素和各種生長因子。然而，動物血清成分復(fù)雜，在臨床治療中有一些潛在的風險，而且有引起免疫排斥的可能。使用滋養(yǎng)層細胞(例如腫瘤細胞株K562)是一種有效的NK細胞培養(yǎng)方法。不使用滋養(yǎng)層細胞其培養(yǎng)效果和培養(yǎng)純度均不夠理想，使用滋養(yǎng)層細胞會得到純度較高的NK細胞，但是K562細胞本身是一種腫瘤細胞，所以其安全隱患仍然沒有排除。免疫磁珠的方法過程繁瑣，成本較高，并且純的NK細胞增殖速度較慢，還會引入外源性物質(zhì)(磁珠、洗脫液中的成分和抗體等)。所以，人們一直嘗試只用純細胞因子的方法擴增NK細胞，但是只用純細胞因子的方法一般只能讓NK細胞擴增幾十倍甚至只有十幾倍，而且純度也不高，仍然限制了NK細胞的臨床使用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種從外周血中高效高純度擴增自然殺傷細胞的方法，該方法不含任何異體血清成分，不使用滋養(yǎng)層細胞，而且不依靠磁珠分選提高NK純度，從而很大程度上提高了NK細胞的安全性和可靠性，具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明提供了一種從外周血中高效高純度擴增自然殺傷細胞的方法，包括：