[發(fā)明專利]一種用于檢測雞傳染性喉氣管炎病毒的RPA引物及其檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710672708.5
• 申請日: 2017-08-08
• 公開（公告）號: CN107287353B
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙軍;王川慶;高冬生;楊霞;王新衛(wèi);李永濤;常洪濤;陳陸;劉紅英;姚惠霞
• 申請（專利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 陳大通

本發(fā)明公開了一種用于檢測雞傳染性喉氣管炎病毒的RPA引物，所述RPA引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，該RPA引物特異性強，靈敏度高，檢測結(jié)果準確。本發(fā)明還提供了一種用于檢測雞傳染性喉氣管炎病毒的RPA方法，本發(fā)明的檢測方法不僅易于操作，對設(shè)備要求低，而且特異性強，靈敏度高，結(jié)果準確可靠，為有效檢測和診斷雞傳染性喉氣管炎提供了一種成本低、快速、特異的現(xiàn)場診斷方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測雞傳染性喉氣管炎病毒的RPA引物及其檢測方法。

背景技術(shù)

雞傳染性喉氣管炎是由傳染性喉氣管炎病毒(Infectious LaryngotracheitisVirus，ILTV)引起的一種急性、接觸性上部呼吸道傳染病。本病傳播快，死亡率較高，在我國較多地區(qū)發(fā)生和流行，危害養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，只有對該疫病進行快速的現(xiàn)場診斷，才能為疫病的有效防控爭取寶貴時間，最大限度地減少損失和疫病的進一步傳播。

常規(guī)的聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)以其能夠檢測痕量的病原DNA而一直被作為診斷多種疫病的金標方法。但PCR需要特殊的熱循環(huán)設(shè)備、低溫保存的試劑和避免交叉污染的技術(shù)操作要求，從而限制了PCR在現(xiàn)場診斷中的應(yīng)用。重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技術(shù)是由英國公司TwistDx Inc開發(fā)的一種可以替代傳統(tǒng)PCR的新型核酸檢測技術(shù)。RPA技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶(Recombinase)、單鏈結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶(Polymerase)。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應(yīng)溫度在37℃-42℃左右。重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動DNA合成，對模板上的目標區(qū)域進行指數(shù)式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，防止進一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進行得非常快，一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴增產(chǎn)物。該技術(shù)對硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于現(xiàn)場診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。RPA技術(shù)具有不同于常規(guī)PCR的諸多優(yōu)點：1)RPA反應(yīng)在常溫下即可進行；2)RPA檢測的靈敏度很高；3)既可用于DNA，也可用于RNA的擴增；4)可以進行多重擴增。

免疫膠體金技術(shù)(Immune Colloidal Gold Technique)是以膠體金作為示蹤標志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術(shù)，英文縮寫為：GICT。膠體金是由氯金酸(HAuCl₄)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細胞生物學(xué)等領(lǐng)域。膠體金免疫層析法是將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標記試劑(抗體或單克隆抗體)吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標記試劑后相互反應(yīng)，再移動至固定的抗原或抗體的區(qū)域時，待檢物與金標試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條，使用十分方便。