[發明專利]一種用于檢測雞傳染性喉氣管炎病毒的RPA引物及其檢測方法

有效

• 申請號: 201710672708.5
• 申請日: 2017-08-08
• 公開（公告）號: CN107287353B
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: 趙軍;王川慶;高冬生;楊霞;王新衛;李永濤;常洪濤;陳陸;劉紅英;姚惠霞
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 陳大通

1.一種用于檢測雞傳染性喉氣管炎病毒的RPA引物，其特征在于，所述RPA引物的核苷酸序列為：

上游引物：5’-CTGCCTAAGCGAGGCTCCGCACCGGAGACTCAGGAATG-3’（SEQ ID NO.1）；

下游引物：5’-CAATTCAGCCGAGGATTTGGGCCGCTCACCGCCAGAGC-3’（SEQ ID NO.2）。

2.根據權利要求1所述的RPA引物，其特征在于，所述上游引物的5’端采用羧基熒光素FAM進行標記，所述下游引物的5’端采用biotin進行標記。

3.權利要求1或2所述的RPA引物在制備檢測雞傳染性喉氣管炎病毒試劑中的應用。

4.含有權利要求1或2所述RPA引物的試劑盒。

5.權利要求4所述的試劑盒在檢測雞傳染性喉氣管炎病毒中的應用，所述應用不以疾病檢測和/或治療為目的。

6.一種用于檢測雞傳染性喉氣管炎病毒的RPA方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）引物合成：合成權利要求1或2所述的RPA引物；

（2）DNA 模板提取：提取待檢測樣品中的DNA；

（3）RPA擴增反應：以步驟（2）提取的DNA為模板，采用步驟（1）中合成的RPA引物，在RPA反應管中進行RPA擴增反應；

（4）分析RPA擴增產物；

所述的RPA方法不以疾病檢測和/或治療為目的。

7.根據權利要求6所述的RPA方法，其特征在于，所述RPA擴增反應體系以50μL計為：

模板DNA 2.0 μL

上游引物 2.0μL

下游引物 2.0μL

水化緩沖液 29.5μL

醋酸鎂 2.5 μL

無核酸酶純水 12.0μL

其中，上游引物和下游引物的初始濃度均為250nM，所述醋酸鎂的初始濃度為280mM。

8.根據權利要求6所述的RPA方法，其特征在于，步驟（4）中分析RPA擴增產物的方法為：將RPA擴增產物稀釋，然后用膠體金側向流免疫層析試紙條對稀釋后的RPA擴增產物進行檢測。

9.根據權利要求8所述的RPA方法，其特征在于，所述膠體金側向流免疫層析試紙條中的有色顆粒是納米金顆粒，所述納米金顆粒采用鏈霉親和素包被。

10.根據權利要求8所述的RPA方法，其特征在于，所述膠體金側向流免疫層析試紙條上設有抗羧基熒光素抗體檢測線和生物素化抗體質控線；若膠體金側向流免疫層析試紙條的抗羧基熒光素抗體檢測線出現條帶，而且生物素化抗體質控線正常，則表明該樣品中含有雞傳染性喉氣管炎病毒，若僅是生物素化抗體質控線上出現條帶，則表明該樣品中不含雞傳染性喉氣管炎病毒。