[發明專利]一種海水魚類的精巢冷凍保存劑及精原細胞的制備方法

在審

• 申請號: 201710670046.8
• 申請日: 2017-08-08
• 公開（公告）號: CN107306940A
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發明（設計）人: 徐冬冬;樓寶;詹煒;陳睿毅;劉峰
• 申請（專利權）人: 浙江省海洋水產研究所
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 青島合創知識產權代理事務所(普通合伙)37264
• 代理人: 王曉曉

技術領域

本發明屬于海洋生物技術領域，具體涉及一種海水魚類的精巢冷凍保存劑及精原細胞的制備方法。

背景技術

魚類生殖細胞移植，即通過顯微注射的方法，將供體魚的生殖細胞注射到宿主魚的腹腔中，移植后的細胞通過偽足遷移至生殖腺中進行發育，進而形成生殖細胞，最終生成供體來源的成熟配子，這項技術也被稱為魚類的“借腹生子”技術，為優良珍稀物種的種質資源保存創建了新途徑。經過實驗探索發現，A型精原細胞是進行移植的有效生殖細胞，可以從魚類精巢中提取制備。如果能夠將魚類精巢長期凍存，并將解凍后精巢制備生殖細胞移植到受體，將大大拓寬魚類生殖細胞移植技術的應用范圍和途徑。因此，解決精巢長期保存并制備可供移植的生殖細胞是該技術的關鍵步驟之一。

超低溫冷凍保存是種質資源長期保存的重要方法之一。超低溫保存的樣品可進行長距離的運輸，同時可以根據需要進行解凍，提高其利用率，是進行精巢長期保存的可行途徑之一。1953年，Blaxter嘗試冷凍保存大西洋鯡魚(Clupea harengus)精巢以達到保存精子的目的，在其后的60多年里，世界許多國家的科研工作者圍繞超低溫保存的降溫方法、抗凍液的篩選、冷凍、解凍速率等方面開展了大量的研究工作，建立了成熟的超低溫冷凍保存方法。但是，這些研究主要以保存精子、胚胎、組織等為目的，對于是否能夠有效保存精原細胞并未涉及。考慮到不同的細胞或組織的特異性以及魚種的特異性，建立海水魚類的精原細胞冷凍保存方法非常必要。

發明內容

本發明提供了一種海水魚類的精巢冷凍保存劑及精原細胞的制備方法。本發明提供了適合石首魚類精巢冷凍保存的抗凍劑配方，建立了石首魚類精巢冷凍保存和精原細胞制備方法，為生殖細胞移植技術提供技術保障。

為實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案予以實現：

本發明提供了一種海水魚類的精巢冷凍保存劑，所述冷凍保存劑包括：體積比為4-8:1-2: 1-2: 1-2的L-15培養液：卵黃：海藻糖：二甲基亞砜，所述海藻糖的摩爾濃度為1M 。

進一步的：所述冷凍保存劑包括：體積比為7:1:1:1的L15培養液：雞蛋卵黃：海藻糖：二甲基亞砜。

本發明還提供了利用所述的精巢冷凍保存劑的精原細胞的制備方法，它包括以下步驟：

（1）解剖取出雄性魚類的精巢；

（2）取L-15培養液加入到新鮮精巢中，剪碎；將剪碎后的精巢進行離心，棄上清液，再加入L-15培養液反復清洗；

（3）將冷凍管預冷，向其中加入所述冷凍保存劑；將剪碎的精巢移入到加有冷凍保存劑的冷凍管中；冰上冷處理；

（4）再將冷凍管冷處理并保存在液氮中；

（5）將裝有精巢的冷凍管從液氮中取出，對冷凍的精巢進行融化處理；

（6）用L-15培養液清洗融化后的精巢，離心，加入蛋白酶消化液進行消化；

（7）將消化后的組織液過濾，加入DNaseⅠ進行消化，離心棄上清；

（8）然后再加入L-15培養液，使細胞終濃度為5-20×10⁶個細胞，加入染色劑染色；

（9）加入1mL L-15培養液終止反應，離心后棄上清，加入L-15培養液清洗，加入L-15培養液、胎牛血清和DNaseⅠ重新懸浮細胞，置于冰上備用。

進一步的：所述步驟（1）中雄性魚類為石首魚類。

進一步的：所述步驟（1）中所述石首魚類為黃姑魚和鮸魚。

進一步的：所述步驟（5）中所述冷凍精巢的融化處理的步驟為：將裝有精巢的凍存管從液氮中取出，10℃水浴2～3min；然后將精巢移到冰上。

進一步的：所述步驟（6）中消化的步驟為：將融化后的精巢組織離心，采用L-15培養液清洗后，采用2～4倍體積的蛋白酶消化液置于室溫下消化3～5h。

進一步的：所述蛋白酶消化液為：將質量比為0.25% 的胰蛋白酶、4mg/mL的膠原蛋白酶H、質量比為5%的胎牛血清和質量比為0.05% 的DNaseⅠ溶于L-15培養液制得。

進一步的：所述步驟（7）中消化的步驟為：用30～50μL 0.05%的DNaseⅠ置于4℃消化10 min。

進一步的：所述步驟（9）中加入5% 胎牛血清和0.5% DNaseⅠ于細胞懸浮液中。