[發(fā)明專利]一種海水魚類的精巢冷凍保存劑及精原細(xì)胞的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710670046.8
• 申請日: 2017-08-08
• 公開（公告）號: CN107306940A
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐冬冬;樓寶;詹煒;陳睿毅;劉峰
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省海洋水產(chǎn)研究所
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 青島合創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)37264
• 代理人: 王曉曉

1.一種海水魚類的精巢冷凍保存劑，其特征在于：所述冷凍保存劑包括：體積比為4-8:1-2: 1-2: 1-2的L-15培養(yǎng)液：卵黃：海藻糖：二甲基亞砜，所述海藻糖的摩爾濃度為1M 。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海水魚類的精巢冷凍保存劑，其特征在于：所述冷凍保存劑包括：體積比為7:1:1:1的L15培養(yǎng)液：雞蛋卵黃：海藻糖：二甲基亞砜。

3.采用權(quán)利要求1所述的精巢冷凍保存劑的精原細(xì)胞的制備方法，其特征在于它包括以下步驟：

（1）解剖取出雄性魚類的精巢；

（2）取L-15培養(yǎng)液加入到新鮮精巢中，剪碎；將剪碎后的精巢進(jìn)行離心，棄上清液，再加入L-15培養(yǎng)液反復(fù)清洗；

（3）將冷凍管預(yù)冷，向其中加入所述冷凍保存劑；將剪碎的精巢移入到加有冷凍保存劑的冷凍管中；冰上冷處理；

（4）再將冷凍管冷處理并保存在液氮中；

（5）將裝有精巢的冷凍管從液氮中取出，對冷凍的精巢進(jìn)行融化處理；

（6）用L-15培養(yǎng)液清洗融化后的精巢，離心，加入蛋白酶消化液進(jìn)行消化；

（7）將消化后的組織液過濾，加入DNaseⅠ進(jìn)行消化，離心棄上清；

（8）然后再加入L-15培養(yǎng)液，使細(xì)胞終濃度為5-20×10⁶個(gè)細(xì)胞，加入染色劑染色；

（9）加入1mL L-15培養(yǎng)液終止反應(yīng)，離心后棄上清，加入L-15培養(yǎng)液清洗，加入L-15培養(yǎng)液、胎牛血清和DNaseⅠ重新懸浮細(xì)胞，置于冰上備用。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的精原細(xì)胞的制備方法，其特征在于：所述步驟（1）中雄性魚類為石首魚類。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的精原細(xì)胞的制備方法，其特征在于：所述步驟（1）中所述石首魚類為黃姑魚和鮸魚。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的精原細(xì)胞的制備方法，其特征在于：所述步驟（5）中所述冷凍精巢的融化處理的步驟為：將裝有精巢的凍存管從液氮中取出，10℃水浴2～3min；然后將精巢移到冰上。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的精原細(xì)胞的制備方法，其特征在于：所述步驟（6）中消化的步驟為：將融化后的精巢組織離心，采用L-15培養(yǎng)液清洗后，采用2～4倍體積的蛋白酶消化液置于室溫下消化3～5h。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的精原細(xì)胞的制備方法，其特征在于：所述蛋白酶消化液為：將質(zhì)量比為0.25% 的胰蛋白酶、4mg/mL的膠原蛋白酶H、質(zhì)量比為5%的胎牛血清和質(zhì)量比為0.05% 的DNaseⅠ溶于L-15培養(yǎng)液制得。

9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的精原細(xì)胞的制備方法，其特征在于：所述步驟（7）中消化的步驟為：用30～50μL 0.05%的DNaseⅠ置于4℃消化10 min。

10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的精原細(xì)胞的制備方法，其特征在于：所述步驟（9）中加入5% 胎牛血清和0.5% DNaseⅠ于細(xì)胞懸浮液中。