[發(fā)明專利]一種奶牛與黃牛異種體外受精胚胎的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710667052.8
• 申請(qǐng)日: 2017-08-07
• 公開（公告）號(hào): CN107365738B
• 公開（公告）日: 2020-02-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張立蘋;林鄭云;鄭新民;畢延震;華再東;曹輝;劉西梅;肖紅衛(wèi);華文君;李莉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12N5/073
• 分類號(hào): C12N5/073
• 代理公司: 42222 武漢科皓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙)
• 代理人: 彭勁松

本發(fā)明公開了一種奶牛與黃牛體外受精胚胎的制備方法。方法中采用屠宰場(chǎng)廢棄的奶牛卵巢，經(jīng)過溫度遞增式的生理鹽水梯度洗滌，抽取其中的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，獲得高質(zhì)量的體外成熟培養(yǎng)的卵母細(xì)胞；高產(chǎn)奶牛精子解凍后置入受精液中用移液槍輕輕吹打后，上下顛倒幾次，于培養(yǎng)箱中上浮，進(jìn)行體外受精，制備高產(chǎn)奶牛與黃牛體外受精胚胎。本發(fā)明采用屠宰場(chǎng)廢棄的卵巢獲得卵母細(xì)胞，提高了母牛資源的利用率。并且通過技術(shù)細(xì)節(jié)的改進(jìn)，獲得了較好的效果。利用本發(fā)明能夠大幅度提高優(yōu)良種公畜的利用率，使優(yōu)良種公畜獲得大量的后代，從而擴(kuò)大其在畜群遺傳改良中的作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于牛繁殖領(lǐng)域，具體涉及奶牛與黃牛異種體外受精胚胎的制備方法。

背景技術(shù)

體外受精技術(shù)是指哺乳動(dòng)物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過程的技術(shù)。應(yīng)用體外受精方法可充分利用屠宰場(chǎng)廢棄的卵巢和優(yōu)質(zhì)奶牛的冷凍精液進(jìn)行胚胎體外生產(chǎn)，不僅成本低廉，而且效果穩(wěn)定，不需要對(duì)母牛進(jìn)行超數(shù)排卵及同期發(fā)情處理，大大減少工作量、降低生產(chǎn)成本，同時(shí)大幅度提高優(yōu)良種公畜的利用率，使優(yōu)良種公畜獲得大量的后代，從而擴(kuò)大其在畜群遺傳改良中的作用。

然而實(shí)際生產(chǎn)中，奶牛飼養(yǎng)成本較高，奶牛的淘汰率偏低，即使淘汰的奶牛也是老弱病殘，因此，屠宰場(chǎng)屠宰的奶牛多是老年奶牛或者生病的奶牛，嚴(yán)重影響了體外受精的效果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于建立一種奶牛與黃牛異種體外受精胚胎的制備方法，為奶牛胚胎生物技術(shù)的應(yīng)用提供合理的技術(shù)路線，充分發(fā)揮高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)奶牛的遺傳潛力。

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種奶牛與黃牛異種體外受精胚胎的制備方法，其步驟為：

(1)將屠宰場(chǎng)采集的黃牛卵巢放入添加雙抗的25℃滅菌生理鹽水中恒溫保存7h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，依次用30℃、35℃無菌生理鹽水洗滌，分別洗滌2次后置39℃水浴鍋中備用，10毫升一次性注射器抽吸法獲取卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)；

(2)將撿取的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)用提前2h于39℃水浴鍋中預(yù)熱的含有5％胎牛血清(FBS)的DPBS緩沖液洗滌3次，再用提前2h于39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱的體外成熟培養(yǎng)液洗滌3次后置于CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，采用五孔板培養(yǎng)，培養(yǎng)濃度：100-150枚/500μL；培養(yǎng)條件39℃,5％CO₂，飽和濕度；培養(yǎng)時(shí)間22-24h；

體外成熟培養(yǎng)液配方：TCM-199(Gibco)+10％FBS+10μL/mL雙抗(即100IU/mL)+10IU/mL人絨毛膜促性腺激素(HMG)+1μg/mL雌二醇(E2)；

(3)奶牛冷凍精液用BO液上浮法處理：從液氮罐取細(xì)管凍精放入37℃水浴中30～40s快速解凍，用75％酒精消毒后剪開細(xì)管，將精子放入含有1mLBO液的離心管中，用移液槍輕輕吹打后，上下顛倒幾次后，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置20-30min，使精子上浮，上浮后將上浮的精子離心處理，1500r/min，5min，用BO，液再次離心處理兩次，1500r/min，5min；

BO液的配方：6.55mg/mL氯化鈉+0.3mg/mL氯化鉀+0.249mg/mL氯化鈣+0.0497mg/mL氯化鎂+0.0869mg/mL磷酸二氫鈉+3.104mg/mL碳酸氫鈉+2.5mg/mL葡萄糖+0.055mg/mL丙酮酸鈉+0.065mg/mL青霉素+0.05mg/mL硫酸鏈霉素；BO，液的配方：BO液+5mM咖啡因+10mg/mL肝素鈉+3mg/mLBSA；

(4)步驟(2)中體外成熟后的卵母細(xì)胞經(jīng)2％透明質(zhì)酸酶消化脫去卵丘細(xì)胞后置于體外受精液BO，中平衡30min；

(5)步驟(3)中處理好的精子加入含有步驟(4)中卵母細(xì)胞的體外受精微滴中，精子的終濃度為3×10⁵個(gè)/mL；