[發明專利]一種奶牛與黃牛異種體外受精胚胎的制備方法

有效

• 申請號: 201710667052.8
• 申請日: 2017-08-07
• 公開（公告）號: CN107365738B
• 公開（公告）日: 2020-02-14
• 發明（設計）人: 張立蘋;林鄭云;鄭新民;畢延震;華再東;曹輝;劉西梅;肖紅衛;華文君;李莉
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 42222 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙)
• 代理人: 彭勁松

1.一種奶牛與黃牛異種體外受精胚胎的制備方法，其步驟為：

（1）將屠宰場采集的黃牛卵巢放入添加雙抗的25℃滅菌生理鹽水中恒溫保存7h內帶回實驗室，依次用30℃、35℃無菌生理鹽水洗滌，分別洗滌2次后置37℃水浴鍋中備用，10毫升一次性注射器抽吸法獲取卵丘-卵母細胞復合體（COCs）；

（2）將撿取的卵丘-卵母細胞復合體（COCs）用提前2h于39℃水浴鍋中預熱的含有5%胎牛血清（FBS）的DPBS緩沖液洗滌3次，再用提前2h于39℃培養箱中預熱的體外成熟培養液洗滌3次后置于CO₂培養箱中進行體外成熟培養，采用五孔板培養，培養濃度：100-150枚/500μL；培養條件39 ℃, 5% CO₂，飽和濕度；培養時間22-24h；

體外成熟培養液配方：TCM-199 +10%FBS+10μL/mL雙抗+10IU/mL人絨毛膜促性腺激素（HMG）+1μg/mL雌二醇（E2）；

（3）奶牛冷凍精液用BO液上浮法處理：從液氮罐取細管凍精放入37℃水浴中30~40s快速解凍，用75%酒精消毒后剪開細管，將精子放入含有1mLBO液的離心管中，用移液槍輕輕吹打后，上下顛倒幾次后，置于二氧化碳培養箱中靜置20-30min，使精子上浮，上浮后將上浮的精子離心處理，1500r/min，5min，用BO^，液再次離心處理兩次，1500 r/min，5min；

BO液的配方：6.55mg/mL氯化鈉+0.3mg/mL氯化鉀+0.249mg/mL氯化鈣+0.0497mg/mL氯化鎂+0.0869mg/mL磷酸二氫鈉+3.104mg/mL碳酸氫鈉+2.5mg/mL葡萄糖+0.055mg/mL丙酮酸鈉+0.065mg/mL青霉素+0.05mg/mL硫酸鏈霉素；BO^，液的配方：BO液+5mM咖啡因+10 mg/mL肝素鈉+3mg/mLBSA；

（4）步驟（2）中體外成熟后的卵母細胞經2%透明質酸酶消化脫去卵丘細胞后置于體外受精液BO^，中平衡30min；

（5）步驟（3）中處理好的精子加入含有步驟（4）中卵母細胞的體外受精微滴中，精子的終濃度為3×10⁵個/mL；

（6）體外受精6h后，用移液器輕輕吹打受精卵，除去浮在受精卵表面的精子，用提前2h于39℃培養箱中預熱的體外受精胚胎培養液洗滌三遍后置于培養液中進行培養；培養濃度：50μL的培養滴中培養10-15個受精卵；24h半量換液，7d后可獲得囊胚；

培養液為CRlaa：114.7mM NaCl、3.1 mM KCl、26.2 mM NaHCO₃、0.4 mM 丙酮酸鈉、5.0mM 乳酸半鈣、3 mg/mL BSA、10μg/mL 酚紅、1.0 mM L-谷氨酰胺、體積分數為2％的Eaa、體積分數為l％的 Nea；

所述的奶牛為西蒙塔爾牛。