[發(fā)明專利]利用巴豆酸激活Zscan4等二細(xì)胞期基因并延長端粒，提高化學(xué)誘導(dǎo)重編程效率的方法

有效

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• 申請日: 2017-08-07
• 公開（公告）號(hào): CN107326007B
• 公開（公告）日: 2020-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 付海峰;劉易飛;田成磊;葉孝穎;繩小艷;劉林
• 申請（專利權(quán)）人: 南開大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/0735
• 分類號(hào): C12N5/0735;C12N5/073
• 代理公司: 天津耀達(dá)律師事務(wù)所 12223
• 代理人: 侯力

本發(fā)明公開了一種利用巴豆酸激活Zscan4等二細(xì)胞期基因表達(dá)，延長端粒，以提高化學(xué)誘導(dǎo)重編程效率的方法。即在化學(xué)誘導(dǎo)過程中的第二階段加入7mM的巴豆酸，可使最終的化學(xué)誘導(dǎo)重編程效率提高三倍左右。本方法獲得的化學(xué)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(chemically induced pluripotent stem cells，CiPSCs)與正常的胚胎干細(xì)胞享有更接近的基因表達(dá)譜。機(jī)制上，在誘導(dǎo)中期加入巴豆酸，可以顯著激活包括Zscan4等二細(xì)胞期基因表達(dá)，迅速延長端粒，從而降低端粒區(qū)域的DNA損傷，提高化學(xué)誘導(dǎo)重編程的效率。本方法誘導(dǎo)得到的化學(xué)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞應(yīng)用前景非常廣泛，在組織工程、再生醫(yī)學(xué)等方面具有巨大的應(yīng)用潛能。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及提高化學(xué)誘導(dǎo)重編程效率的方法。具體而言，本發(fā)明涉及在化學(xué)誘導(dǎo)中期加入化學(xué)物質(zhì)巴豆酸，通過激活包括Zscan4在內(nèi)的一系列二細(xì)胞期基因的表達(dá)，迅速延長端粒，從而減少端粒區(qū)域的基因組損傷，提高最終的化學(xué)誘導(dǎo)重編程效率。

背景技術(shù)

近年來，小鼠和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(下文稱為iPS)已相繼建立，這類細(xì)胞的建立需要依靠強(qiáng)制表達(dá)一系列外源轉(zhuǎn)錄因子組合，如Oct4，Sox2，Klf4等。但是介導(dǎo)外源基因表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒有潛在的安全問題，不管是逆轉(zhuǎn)錄病毒,還是慢病毒,都會(huì)把外源基因整合到基因組DNA中,這就有可能引起插入突變，造成潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)，不利于iPS的臨床應(yīng)用。因此，降低基因整合風(fēng)險(xiǎn)和致癌性的方法之一就是減少外源轉(zhuǎn)錄因子，而這同時(shí)伴隨著誘導(dǎo)效率的降低。加入一些化學(xué)小分子，如VPA,BIX,Vc等，可以顯著提高重編程的效率，但是潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)依然使得iPS距離臨床應(yīng)用非常遙遠(yuǎn)。

通過不斷的努力和嘗試，鄧宏魁課題組首次利用小分子化合物將小鼠成纖維細(xì)胞成功誘導(dǎo)為化學(xué)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(下文稱為CiPS)，這就避免了外源基因整合進(jìn)基因組的風(fēng)險(xiǎn)。但是過低的誘導(dǎo)效率和過長的誘導(dǎo)時(shí)間仍然大大地限制了CiPS的臨床應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是解決因外源基因整合到基因組DNA中可能造成潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)以及減少外源轉(zhuǎn)錄因子而伴隨著誘導(dǎo)效率降低的問題，提供一種利用巴豆酸激活Zscan4等二細(xì)胞期基因表達(dá)，延長端粒，以提高化學(xué)誘導(dǎo)重編程效率的方法。

本發(fā)明試圖通過篩選其他化學(xué)小分子以提高化學(xué)誘導(dǎo)重編程的效率，并提高CiPS的質(zhì)量。具體而言，利用一種小分子化合物巴豆酸，在化學(xué)誘導(dǎo)過程中第二階段加入后，可以顯著提高最終的化學(xué)誘導(dǎo)效率，并且這種方法得到的CiPS具備與正常胚胎干細(xì)胞更接近的基因表達(dá)譜，其安全性與有效性可轉(zhuǎn)化于未來臨床應(yīng)用。

通過不斷的嘗試，我們發(fā)現(xiàn)7mM的巴豆酸(crotonic acid，以下簡稱CA)在化學(xué)誘導(dǎo)中期加入，可以使化學(xué)誘導(dǎo)效率提高3倍左右。

本發(fā)明技術(shù)方案

利用巴豆酸激活Zscan4等二細(xì)胞期基因表達(dá)并延長端粒，以提高化學(xué)誘導(dǎo)重編程效率的方法，包括如下步驟：

第1.MEF細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)；

通過貼壁培養(yǎng)，從處死的孕鼠組織獲得原代MEF細(xì)胞；

第2.加入巴豆酸獲得化學(xué)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；

將第1步中獲得的原代MEF細(xì)胞，培養(yǎng)至多3代作為前體細(xì)胞用于化學(xué)誘導(dǎo)重編程，以提高化學(xué)誘導(dǎo)重編程效率。

其中，第2步所述加入巴豆酸獲得化學(xué)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法如下：