[發明專利]利用巴豆酸激活Zscan4等二細胞期基因并延長端粒，提高化學誘導重編程效率的方法

有效

• 申請號: 201710665689.3
• 申請日: 2017-08-07
• 公開（公告）號: CN107326007B
• 公開（公告）日: 2020-06-12
• 發明（設計）人: 付海峰;劉易飛;田成磊;葉孝穎;繩小艷;劉林
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12N5/073
• 代理公司: 天津耀達律師事務所 12223
• 代理人: 侯力

1.一種利用巴豆酸激活Zscan4二細胞期基因表達并延長端粒，以提高化學誘導重編程效率的方法，包括如下步驟：

第1.MEF細胞的分離和原代培養；

通過貼壁培養，從處死的孕鼠組織獲得原代MEF細胞；

第2.加入巴豆酸獲得化學誘導多能干細胞；

將第1步中獲得的原代MEF細胞，培養至多3代作為前體細胞用于化學誘導重編程，以提高化學誘導重編程效率；方法如下：

首先在六孔板中接種50000個原代MEF細胞，轉天待細胞貼壁后換上化學誘導培養液A，記為第0天，0-12天每隔3天換液；在第12天時，細胞用胰酶消化后，以每個六孔100000-200000個細胞重新接種，培養至第16天，此時誘導培養液改為誘導培養液AA；所述誘導培養液A包括以下成分：100ng/ml bFGF,0.5mM VPA,20μM CHIR99021,10μM Repsox,5μMTranylcypromine,50μM Forskolin,0.05μM AM580和5μM EPZ004777；誘導培養液AA是將誘導培養液A中的bFGF、CHIR99021和Forskolin分別減量至25ng/ml、10μM和10μM，其他成分不變；

在第16天時，細胞換上誘導培養液B，培養至第28天，每隔3天換液；在第28天時，細胞換上N2B27+2iLIF培養液，再經過8-12天的培養，原代CiPS克隆出現，挑出后進行增擴和進一步鑒定；所述誘導培養液B的成分如下：25ng/ml bFGF,0.5mM VPA,10μM CHIR99021,10μMRepsox,5μM Tranylcypromine,10μM Forskolin,0.05μM AM580,0.05μM DZNep,0.5μM 5-aza-dC，5μM SGC0946和7mM巴豆酸；N2B27+2iLIF培養液成分為：F12和Neurobasal的1：1混合液，并添加N2,B27,3μM CHIR99021,1μM PD0325901和1000U/ml mLIF。

2.根據權利要求1所述的利用巴豆酸激活Zscan4二細胞期基因表達并延長端粒，以提高化學誘導重編程效率的方法，其特征在于，所述原代CiPS進行增擴時使用的CiPS傳代培養液為knock-out DMEM添加20％血清,1000U/ml mLIF，3μM CHIR99021和1μM PD0325901。