[發明專利]基于半環狀LED照明的差分相襯顯微成像方法

有效

• 申請號: 201710660630.5
• 申請日: 2017-08-04
• 公開（公告）號: CN107272178B
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發明（設計）人: 左超;李加基;陳錢;孫佳嵩;張佳琳;顧國華;張玉珍;范瑤;馮世杰;陶天陽;胡巖;張良
• 申請（專利權）人: 南京理工大學
• 主分類號: G02B21/06
• 分類號: G02B21/06;G02B21/08;G02B21/14
• 代理公司: 南京理工大學專利中心 32203
• 代理人: 唐代盛

本發明公開了一種基于半環狀LED照明的差分相襯顯微成像方法，首先利用弱物體近似，推導在部分相干照明成像系統中弱物體的光學傳遞函數表達式；計算半環狀照明下差分相襯成像的相位傳遞函數；在LED陣列上依次顯示兩個不同方向上的環狀照明圖案，并且產生同步觸發信號至相機；改變環狀照明圖案方向，并且產生同步觸發信號至相機，在不同方向上的環狀照明圖案對應的觸發信號下，相機采集一系列強度圖像；由差分相襯成像計算公式即可計算出在不同方向下的差分相襯圖像，從而實現在上下左右及各個不同方向上實現差分相襯成像。本發明可對差分相襯圖像中相位的低頻進行提升，使差分相襯圖像的凹凸感更強，增強了圖像的成像質量。

技術領域

本發明屬于光學顯微測量、成像技術，特別是一種基于半環狀LED照明的差分相襯顯微成像方法。

背景技術

在生物醫學顯微成像領域，大部分活細胞和未染色的生物標本都是無色透明的，這是因為細胞內各部份細微結構的折射率和厚度的不同，當光波通過時，波長和振幅并不發生變化，僅相位發生變化，但這種相位差人眼無法觀察。這就需要通過一些化學或者生物手段來對細胞進行染色，從而使其在顯微鏡下可見。由于生物細胞內部不同物質對有色染料吸收的吸收率不同，故最終在顯微鏡下就可以看見生物細胞內部的結構和表現出不同的生物特性(龔志錦,詹熔洲.病理組織制片和染色技術[M].上海科學技術出版社,1994)。但由于這種染色手段會對細胞和組織的正常生理活動造成影響，更有可能會殺死細胞。其中熒光標記成像可以提高顯微成像的分辨率，但是同樣由于熒光蛋白劑進入細胞之后會給細胞的正常代謝和生長帶來影響，不利于細胞的長時間觀察(Sarder P,NehoraiA.Deconvolution methods for 3-D fluorescence microscopy images[J].IEEE SignalProcessing Magazine,2006,23(3):32-45)。

無標記成像對長時間的活細胞觀察是一種有效的成像方式，其中最常見的成像模式是相差顯微成像與差分相襯顯微成像。1935年荷蘭科學家Zernike利用相差顯微成像技術發明了相差顯微鏡，并將其用于觀察未染色標本。相差顯微鏡利用物體不同結構成分之間的折射率和厚度的差別，把通過物體不同部分的光程差轉變為振幅(光強度)的差別，經過帶有環狀光闌的聚光鏡和帶有相位片的相差物鏡實現觀測。該顯微鏡主要用于觀察活細胞或不染色的組織切片，有時也可用于觀察缺少反差的染色樣品。光線透過標本后發生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了1/4λ(波長)，如果再增加或減少1/4λ，則光程差變為1/2λ，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減下，提高反差，從而實現對未染色細胞和生物組織的相位進行觀察。

而差分相襯成像也是一種常見的顯微成像方法，類似于微分干涉顯微成像的成像效果。該成像方法利用非對稱照明，并采集每種非對稱照明圖案下對應的多幅強度圖像，并計算得到差分相襯圖像。最終可使樣品的細微結構呈現出正或負的投影形象，通常是一側亮，而另一側暗，類似大理石上的浮雕，這樣便人為地造成了待測樣品的三維立體感。2015年，田磊等人詳細的從理論上推導和解釋了基于LED陣列的差分相襯顯微成像系統中的傳遞函數(Tian L,Waller L.Quantitative differential phase contrast imaging in anLED array microscope[J].Optics express,2015,23(9):11394-11403)，并且分析了在科勒照明(illumination)中圓形照明孔徑在不同的相干系數下差分相襯成像的傳遞函數響應等問題，其中相干系數的定義為照明數值孔徑與物鏡數值孔徑之比，σ＝NA_ill/NA_obj；當σ≈0時成像系統為相干照明系統如圖1(a)所示，而當σ≤1時成像系統為部分相干照明系統如圖1(b)所示。雖然該方法能夠實現基于LED陣列的差分相襯成像，但是基于傳統半圓形照明孔徑對差分相襯圖像中相位低頻成分的成像效果依舊有待提升，也為后續從差分相襯圖像中恢復相位帶來了困難。所以如何在保證差分相襯成像效果的前提下對圖像中相位的低頻進行提升成為差分相襯成像技術對無標記樣品觀察中的一個技術難題。

發明內容