[發明專利]基于半環狀LED照明的差分相襯顯微成像方法

有效

• 申請號: 201710660630.5
• 申請日: 2017-08-04
• 公開（公告）號: CN107272178B
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發明（設計）人: 左超;李加基;陳錢;孫佳嵩;張佳琳;顧國華;張玉珍;范瑤;馮世杰;陶天陽;胡巖;張良
• 申請（專利權）人: 南京理工大學
• 主分類號: G02B21/06
• 分類號: G02B21/06;G02B21/08;G02B21/14
• 代理公司: 南京理工大學專利中心 32203
• 代理人: 唐代盛

1.一種基于半環狀LED照明的差分相襯顯微成像方法，其特征在于步驟如下：

步驟一，對部分相干成像系統的光學傳遞函數進行推導，利用弱物體近似，推導在部分相干照明成像系統中弱物體的光學傳遞函數表達式；

步驟二，計算半環狀LED照明的差分相襯成像的相位傳遞函數，當照明模式由圓形部分相干照明圖案退化為單個傾斜相干點光源，得到相干傾斜照明成像系統的相位傳遞函數，此時相干點光源分別內切在物鏡光瞳的邊緣，再由傾斜相干點光源擴展到半環狀離散相干點光源，即可推導出半環狀LED照明模式下的相位傳遞函數；再利用差分相襯成像計算公式得到半環狀照明下差分相襯成像的相位傳遞函數；

步驟三，在LED陣列上依次顯示兩個不同方向上的環狀照明圖案，并且產生同步觸發信號至相機，使相機采集對應方向上半環狀圖案下的強度圖像；

步驟四，改變顯示的環狀照明圖案方向，并采集一系列強度圖像，即依次顯示左右、上下、左下右上及左上右下四個方向上的半環狀LED照明圖案，并且依次產生同步觸發信號至相機，在不同方向上的環狀照明圖案對應的觸發信號下，相機采集一系列強度圖像I₁,I₂,I₃,I₄...；

步驟五，由差分相襯成像計算公式即可計算出在不同方向下的差分相襯圖像和從而實現在上下左右及各個不同方向上實現差分相襯成像。

2.根據權利要求1所述的基于半環狀LED照明的差分相襯顯微成像方法，其特征在于在步驟一中：在基于半環狀LED照明的差分相襯成像裝置構成的無窮遠校正成像系統中，對于非相干照明來說相機所處的成像平面上所采集的強度圖像為

其中，r為空域中的二維變量，h(r)為成像系統的振幅點擴散函數，t(r)為物體的復振幅，I_u(r)表示在光源面上所有點光源產生的強度的疊加；其中t(r)＝a(r)exp[iφ(r)]，a(r)為物體的吸收，φ(r)則為物體的相位；

而對于相干成像系統來說光強圖像則可表示為

對于一個部分相干成像系統來說，通過引入弱物體近似，在相機的成像平面所采集的光強的傅里葉變換與成像系統之間的數學關系可表示為

其中表示傅里葉變換，u表示在頻域極坐標系中的二維變量，δ表示單位沖激函數；上式中的第一項表示背景光強，即透射光線總能量，其達表示為：

B＝∫∫S(u')|P(u')|²du'

其中，S(u)為在聚光鏡的前焦面上的光源分布，P(u)為顯微物鏡的光瞳函數，其絕對值可表達為

其中ρ_P為顯微物鏡光瞳的歸一化截止頻率；而后面兩項分別表示系統的吸收分量和相位分量，其中H_A(u)和分別表示系統的振幅傳遞函數和物體振幅的傅里葉變換，H_P(u)和表示系統的相位傳遞函數和物體相位的傅里葉變換；對樣品吸收成分的頻率響應可以用振幅傳遞函數表示為：

H_A(u)＝-[∫∫S(u')P^*(u')P(u'+u)du'+∫∫S(u')P^*(u')P(u'-u)du']

而對相位成分的頻率響應則可表達為相位傳遞函數：

H_P(u)＝i[∫∫S(u')P^*(u')P(u'+u)du'-∫∫S(u')P^*(u')P(u'-u)du']

以上公式即為引入弱物體近似后的成像系統振幅與相位的傳遞函數，上述u'為頻域中臨時積分變量。

3.根據權利要求1所述的基于半環狀LED照明的差分相襯顯微成像方法，其特征在于在步驟二中：

如果光源分布S(u)為非軸對稱函數，在LED陣列所處的光源面引入一個傾斜相干點光源，其光源分布S(u)為

S(u)＝δ(u-ρ_s)

其中δ表示單位沖激函數，ρ_s為點光源到光源中心的頻率歸一化距離；將S(u)代入相位傳遞函數中，即可得到在聚焦位置處對非對稱點光源的相位傳遞函數為：

H_P(u)＝P(u+ρ_s)-P(u-ρ_s)

此時傾斜相干點光源是內切于顯微物鏡光瞳，故有|ρ_s|＝|ρ_p|，其中ρ_p為物鏡光瞳空間截止歸一化頻率；利用相干模式分解理論，半環狀LED照明圖案可被分解為許多傾斜干點光源，其光學傳遞函數可以被當成是每一個傾斜相干點光源的非相干疊加；最終顯示在LED陣列上的半環狀光源S(u)表示為：

其中N為被點亮的LED數量，且半環狀照明圖案上的每個點光源的空間頻率等于物鏡光瞳的空間頻率，即|ρ_s|＝|ρ_p|；最終可以推導出半環狀LED照明模式下的相位傳遞函數：

通過計算不同方向的光源分布S(u)下的強度，并且利用差分相襯成像計算公式：

其中I₁和I₂分別表示兩個半徑相同方向相反的半環狀光源所采集的光強；最終可以消去強度圖像中的吸收項，即H_A(u)＝0，得到基于半環狀LED照明的差分相襯成像的相位傳遞函數為：

為了滿足成像方法所需的最小頻域采樣率，所采用的顯微物鏡數值孔徑為NA_obj，其放大倍率為Mag，相機像元尺寸為Δx_cam，這幾者之間滿足當使用不同數控孔徑的顯微物鏡時，通過對LED陣列重新編程改變環狀照明圖案使其重新內切與顯微物鏡光瞳，滿足條件此時照明半環半徑大小始終與物鏡數值孔徑相匹配，即可實現適用于不同數值孔徑的顯微物鏡的半環狀可編程照明。