[發(fā)明專利]臨床應用級臍帶間充質干細胞及其分離制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710660629.2
• 申請日: 2017-08-04
• 公開（公告）號: CN109385396A
• 公開（公告）日: 2019-02-26
• 發(fā)明（設計）人: 嚴小敏;馬穎;王春慧;朱江;戴果鮮;邵小燕
• 申請（專利權）人: 上海賽傲生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 上海申浩律師事務所 31280
• 代理人: 沈其梅

本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體涉及從臍帶華通氏膠中分離獲得高純度、高活力間充質干細胞的方法。該方法通過篩選獲得臍帶組織，經消毒清洗、華通氏膠分離、組織塊制備、組織塊接種、細胞原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)等步驟，獲得高純度、高活力的臍帶間充質干細胞。本發(fā)明使臍帶間充質干細胞生產工藝更加標準和規(guī)范，特別適用于臨床。

技術領域

本發(fā)明屬于生物工程技術領域，特別涉及到從臍帶華通氏膠中分離臨床應用級間充質干細胞的方法。

背景技術

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)存在于骨髓、脂肪、臍帶等多種組織器官中，因其具有高度自我更新和多向分化潛能，在臨床造血支持、促進干細胞植入和免疫調控等方面的應用日益受到人們的關注。在燒傷、骨折、缺損軟組織填充、終末期肝病、心肌梗死、糖尿病足等創(chuàng)傷或疾病的治療均證實了其安全性和有效性。

臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細胞，其來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。臍帶取自于圍產期健康產婦生產后的遺棄物，取材方便，對產婦和嬰兒健康沒有影響，倫理學爭議小。臍帶在間充質干細胞含量和增殖能力方面都優(yōu)于骨髓，并且臍帶來源的細胞免疫原性比骨髓低。臍帶間充質干細胞具有無限增殖的可能，體外12代以內保持核型正常及端粒酶活性，說明臍帶間充質干細胞無致瘤性。其表面抗原不明顯，不表達MHC-Ⅱ類抗原，低表達MHC-Ⅰ類抗原，異體移植排異較輕，臨床使用無需配型。臍帶間充質干細胞能抑制T、B、NK、DC細胞的免疫調節(jié)作用，其異體免疫原性及免疫排斥很低。臍帶間充質干細胞可以分化成多種組織細胞，可以作為種子細胞進行儲存，用于衰老和病變等引起的組織器官損傷的修復。能分泌VEGF、bFGF、HGF等細胞因子，促進血管再生，分泌NGF、BDGF、G-CSF等神經營養(yǎng)因子，促進神經細胞的再生修復。

目前，已有多個單位申請了臍帶間充質干細胞分離相關的專利，其中有使用膠原酶或復合酶消化進行細胞的分離(ZL201611173913.9、ZL201611174018.9、ZL201611037484.2、ZL201610910565.2、ZL201510395470.7等)，有將臍帶進行去血管后剪碎或者直接剪碎后進行組織貼壁獲取細胞(ZL201610910134.6、ZL201410751410.X、ZL201410515345.0、ZL201010605542.3、ZL201410515345.0、ZL201510191059.8等)，也有通過分離華通氏膠剪碎后貼壁獲取細胞(ZL201710067279.9、ZL201610615998.5、ZL201610311244.0、ZL201510945799.6、ZL201510423138.7)。通過酶消化獲取細胞的時間較短，但酶會對細胞的活力有一定的影響。直接剪碎貼壁操作簡單，但細胞的純度低，不利于獲取純度高的細胞。分離華通氏膠剪碎貼壁的方法，獲取細胞純度高，但細胞爬出的時間較長。因此，需要對臍帶處理的方法進行改進，才能獲取到活力更強、純度更高的細胞。

發(fā)明內容

本發(fā)明的主要目的在于建立臨床應用級臍帶間充質干細胞的分離制備方法，所述臍帶間充質干細胞來自于分離的華通氏膠。

本發(fā)明的技術方案如下：

本發(fā)明提供臨床應用級臍帶間充質干細胞的分離制備方法，所述方法包括以下步驟：

(1)獲取人源特異性病毒血檢報告結果為陰性的臍帶；

(2)取組織保存液進行支原體檢測后，處理臍帶，分離華通氏膠，并用生理鹽水充分洗滌華通氏膠；

(3)用無菌剪刀將華通氏膠剪碎，洗滌離心后，采用組織貼壁法培養(yǎng)臍帶間充質干細胞，當細胞融合度達到80％以上時，加入消化酶進行消化處理后，過濾收集單細胞懸液，獲得臍帶間充質干細胞的原代細胞。

上述制備方法還包括以下步驟：