[發明專利]臨床應用級臍帶間充質干細胞及其分離制備方法在審
| 申請號： | 201710660629.2 | 申請日： | 2017-08-04 |
| 公開（公告）號： | CN109385396A | 公開（公告）日： | 2019-02-26 |
| 發明（設計）人： | 嚴小敏;馬穎;王春慧;朱江;戴果鮮;邵小燕 | 申請（專利權）人： | 上海賽傲生物技術有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/0775 | 分類號： | C12N5/0775 |
| 代理公司： | 上海申浩律師事務所 31280 | 代理人： | 沈其梅 |
| 地址： | 200333 上海市普*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 臍帶間充質干細胞 高純度 組織塊 制備 生物工程技術領域 間充質干細胞 臍帶華通氏膠 細胞原代培養 傳代培養 臨床應用 臍帶組織 生產工藝 接種 清洗 消毒 篩選 | ||
1.臨床應用級臍帶間充質干細胞的分離制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)獲取人源特異性病毒血檢報告結果為陰性的臍帶；
(2)取組織保存液進行支原體檢測后，處理臍帶，分離華通氏膠，并用生理鹽水充分洗滌華通氏膠；
(3)用無菌剪刀將華通氏膠剪碎，洗滌離心后，采用組織貼壁法培養臍帶間充質干細胞，當細胞融合度達到80％以上時，加入消化酶進行消化處理后，過濾收集單細胞懸液，獲得臍帶間充質干細胞的原代細胞。
2.如權利要求1所述臨床應用級臍帶間充質干細胞的分離制備方法，其特征在于，還包括以下步驟：
(4)將步驟(3)獲得的臍帶間充質干細胞的原代細胞凍存。
3.如權利要求1或2所述臨床應用級臍帶間充質干細胞的分離制備方法，其特征在于，所述血檢報告項目包括HIV、HBV、HCV、TP、EB和CMV人源特異性病毒。
4.如權利要求3所述臨床應用級臍帶間充質干細胞的分離制備方法，其特征在于，所述血檢報告為產婦外周血和臍帶血的血檢報告。
5.如權利要求1或2所述臨床應用級臍帶間充質干細胞的分離制備方法，其特征在于，步驟(2)中支原體檢測結果為陰性，用磷酸鹽緩沖液洗滌臍帶，所述磷酸鹽緩沖液含有10萬單位/L的氨基青霉素和100mg/L的硫酸鏈霉素；步驟(3)所述消化酶為0.125％的胰蛋白酶。
6.如權利要5所述臨床應用級臍帶間充質干細胞的分離制備方法，其特征在于，
步驟(3)中先將華通氏膠轉移至離心管中離心，取上層的洗滌液進行無菌檢測；再將華通氏膠用無菌剪刀剪成1-3mm3大小的組織塊，所述華通氏膠組織塊接種前，加入培養臍帶間充質干細胞的專用培養基洗滌，離心后，取上層培養基進行無菌檢測，下層組織塊用于接種。
7.如權利要求6所述臨床應用級臍帶間充質干細胞的分離制備方法，其特征在于，
步驟(3)向組織塊中加入與組織塊體積等量的培養臍帶間充質干細胞的專用培養基，并充分吹打混合均勻；將組織懸液按照4ml組織懸液每75cm2培養瓶的比例分別接種至若干個培養瓶中，待組織貼壁后，再補加等體積的專用培養基。
8.如權利要求6或7所述臨床應用級臍帶間充質干細胞的分離制備方法，其特征在于，
步驟(3)細胞培養條件為37℃、5％CO2；當所述培養瓶內培養基顏色變黃時，更換全量培養基。
9.如權利要求1、2、6或7所述臨床應用級臍帶間充質干細胞的分離制備方法，其特征在于，所述培養基為無血清培養基。
10.如權利要求1、4、6或7所述臨床應用級臍帶間充質干細胞的分離制備方法，其特征在于，所述病毒、支原體或無菌檢測結果均為陰性。
11.如權利要求9所述臨床應用級臍帶間充質干細胞的分離制備方法制備得到的臨床應用級臍帶間充質干細胞。
12.如權利要求10所述臨床應用級臍帶間充質干細胞的分離制備方法制備得到的臨床應用級臍帶間充質干細胞。
13.如權利要求11或12所述臨床應用級臍帶間充質干細胞，其特征在于，所述細胞為形態均一的長梭形細胞，且CD73、CD90、CD105的陽性比例大于等于95％，CD34、CD45、HLA-DR為的陽性比例小于等于2％。
14.如權利要求1、4、6、7所述臨床應用級臍帶間充質干細胞的分離制備方法，其特征在于，所述方法還包括以下步驟：
將步驟(3)獲得的臍帶間充質干細胞的原代細胞再次重懸后，接種于培養瓶中，進行傳代培養，細胞傳代密度為6000-8000個/cm2。
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