[發明專利]一種質粒載體及其構建方法

有效

• 申請號: 201710656310.2
• 申請日: 2017-08-03
• 公開（公告）號: CN107287230B
• 公開（公告）日: 2020-10-13
• 發明（設計）人: 安迎鋒;高和瑞;高嵩;張藝鋒;許淑敏;劉霞
• 申請（專利權）人: 沈陽農業大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/64
• 代理公司: 北京市領專知識產權代理有限公司 11590
• 代理人: 林輝輪

本發明涉及基因工程領域，具體的說是一種兼具定向TA克隆，無背景粘性末端克隆和表達功能的質粒載體及其構建方法。質粒載體為閉合環狀的雙鏈DNA，含有兩個多克隆位點區，在兩個多克隆位點區之間存在一個ccdB表達框，可在多數大腸桿菌菌株中組成型表達毒性蛋白ccdB，作為負篩選標記。基于質粒載體的多克隆位點的設計，該質粒可用于進行定向TA克隆和改進的無背景粘性末端克隆。另外，本質粒載體還可以直接用于蛋白表達和純化。各功能均得到驗證。本發明所涉及的質粒載體因其更方便和高效，將在基因工程領域發揮重要的作用。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體的說是一種兼具定向TA克隆，無背景粘性末端克隆和表達功能的質粒載體及其構建方法。

背景技術

分子克隆是研究基因結構和功能的基礎，是分子生物學的核心技術。分子克隆方法可分為兩類：依賴連接酶的克隆和不依賴連接酶的克隆。其中，依賴連接酶的克隆方法主要有三種，包括：平末端連接、粘性末端連接和TA克隆。近些年，各種不依賴連接酶的克隆策略也得到快速發展，比如：CPEC、FastCloning、Gateway、LIC、OEC、PIPE、SLIC、SLiCE、USER和重組酶克隆等技術（Yao S, Hart DJ, An Y. Recent advances in universal TAcloning methods for use in function studies. Protein Eng Des Sel. 2016; 1-6.）。盡管不依賴連接酶的克隆方法有很多成功的應用實例，但是仍然不能完全取代依賴連接酶的克隆方法。

作為一種依賴連接酶的克隆方法，粘性末端連接方法是目前應用最為廣泛的分子克隆方法之一。但在某些情況下，由于無法獲取合適的限制性酶切位點，因此為粘性末端克隆帶來了不便。另外，由于產生粘性末端的酶切位點都具有回文結構，經酶切后的末端能與其自身互補，所以容易在后續的克隆步驟中產生兩個質粒載體之間的連接和環化，從而產生假陽性。而TA克隆方法是利用某些DNA聚合酶（如Taq聚合酶）的末端轉移酶活性，在聚合酶鏈式反應（PCR）擴增插入片段的過程中在產物的3'端額外加入一個堿基“A”。而TA克隆所使用的T載體的3'端有一個凸出的堿基“T”，剛好可以與上述插入片段的3'末端的堿基“A”互補配對，通過連接可以實現TA克隆。TA克隆是目前克隆PCR產物最快捷、簡便的方法之一。該方法無需選擇合適的酶切位點，甚至可用于克隆序列未知的DNA片段。目前， T載體的制備方法常見的有兩種。一種方法是在質粒載體的多克隆位點中引入特定的酶切位點，用某些內切酶酶切能夠產生3'端具有單個凸出的堿基“T”的線性T載體。另一種方法是利用某些DNA聚合酶（如Taq酶）不依賴模板的末端轉移酶活性，將單個脫氧胸腺核苷酸（dTTP）添加到線狀載體3'端（Marchuk D, Drumm M, Saulino A, Collins FS. Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCRproducts. Nucleic Acids Res. 1991;19(5):1154.）。與第二種方法相比，第一種方法更穩定、快捷、高效。另外，第二種方法在制備T載體時，會出現加尾效率較低和加尾過程中線性質粒兩端的序列有時會被部分刪除等問題（Shuman S. Novel approach to molecularcloning and polynucleotide synthesis using vaccinia DNA topoisomerase. J BiolChem. 1994 Dec 23;269(51):32678-32684.）。目前TA克隆主要存在的問題是克隆過程中片段可以隨機的以正反兩個方向插入到T載體中，這就造成了至少有一半的克隆外假陽性，從而增加了篩選的壓力。