[發明專利]褐藻膠裂解酶在制備系列寡糖產物中的應用

有效

• 申請號: 201710651814.5
• 申請日: 2017-08-02
• 公開（公告）號: CN107574196B
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 韓文君;程媛媛;王丹丹;李俊鴿;王延輝;李福川;李新;衛潔
• 申請（專利權）人: 濟南悟通生物科技有限公司
• 主分類號: C12P19/02
• 分類號: C12P19/02;C12P19/00;C12P19/04;C12P19/12;A61K31/702;A61K31/7016;A61K31/734;A61K31/7004;A61P11/00;A61P1/00
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

本發明涉及基因工程重組型褐藻膠裂解酶在制備系列寡糖產物中的應用。M?專一性褐藻膠裂解酶在降解底物生成系列不飽和寡糖產物中的應用；所述重組褐藻膠裂解酶為褐藻膠裂解酶Pae?rEAlgL，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者，所述重組褐藻膠裂解酶為褐藻膠裂解酶Avi?rEAlgL，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。褐藻膠裂解酶Pae?rEAlgL和Avi?rEAlgL是M專一性的內切型褐藻膠裂解酶，是一種高效的制備富G段寡糖的工具酶。褐藻膠裂解酶Pae?rEAlgL和Avi?rEAlgL具有適冷特性和廣泛的pH穩定性，有望成為用于治療囊性纖維病的酶制劑。

技術領域

本發明涉及褐藻膠裂解酶在制備系列寡糖產物中的應用，特別涉及兩種甘露糖醛酸(M)專一性的重組褐藻膠裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL在降解由M和古羅糖醛酸(G)混合組成的商品化褐藻膠多糖制備不飽和二糖、不飽和三糖、不飽和四糖、不飽和五糖、不飽和六糖和不飽和七糖的系列寡糖產物中的應用，屬于酶工程技術領域。

背景技術

褐藻膠(Alginate)與瓊膠，卡拉膠并稱三大海洋多糖。褐藻膠的主鏈是由β-D-1,4-甘露糖醛酸(Mannuronate,M)及其C-5差向異構體α-L-1,4-古羅糖醛酸(Guluronate,G)兩種糖單元通過β-1,4糖苷鍵鏈接而成的線性多糖分子。其中，由連續的M糖單元組成的糖鏈稱為聚M段(M block)，連續的G糖單元組成的糖鏈稱為聚G段(G block)，不同的糖單元交替鏈接稱為MG或GM段(MG blocks)。褐藻膠廣泛存在于海帶，巨藻和馬尾藻等大型藻類的細胞壁和胞間質中。某些微生物，如銅綠假單胞菌和棕色固氮菌，也能合成并分泌褐藻膠。與海藻來源的褐藻膠不同，細菌所分泌的褐藻膠在糖單元的O-2或O-3位具有一定程度的乙酰基修飾。褐藻膠無毒無害，具有良好的吸水成膠能力，是良好的支撐材料，因而廣泛應用于化工、醫藥和食品行業。研究還表明，褐藻膠寡糖具有重要生物活性，如抗凝血、降血糖、降血脂、抗自由基、抗腫瘤、免疫保護、促植物生長等。深入研究表明：(1)聚M段和MG段可激活單核細胞，使其產生腫瘤壞死因子TNF-A、IL-1與IL-6，因而具有抗腫瘤活性；(2)耿美玉等以聚M段褐藻膠寡糖為原料，研制的一類候選藥物971，具有抗β-淀粉樣蛋白聚集活性，可用于治療阿爾茲海默癥；(3)聚G段寡糖是掌狀海帶的免疫激發子，能促進海帶幼苗生長、提高海帶抗病力，預防海帶疾病。近年來，褐藻膠寡糖成為一種新的潛在的功能產品不斷受到人們的關注，其高值化研究已經成為新的熱點。

褐藻膠裂解酶是一類多糖裂解酶(Polysaceharide Lyase,PL)，通過β消去反應催化褐藻膠分子內相鄰糖單元之間1,4-O-糖苷鍵的斷裂，并在寡糖產物中新產生的非還原端的糖單元的C4和C5位形成不飽和雙鍵。為區別于飽和的糖單元M和G，通常將這一不飽和的糖單元稱為Δ。這使得：(1)寡糖產物在235nm附近具有特征吸收；(2)不飽和糖單元的存在增加了寡糖產物的脂溶性。相比化學法(酸、堿、氧化)降解或者物理法(微波、超聲)降解，褐藻膠寡糖的酶法降解，具有反應條件溫和、產物結構穩定而明確、環境污染小等優點。褐藻膠裂解酶主要來源于海洋藻類、海洋軟體動物、棘皮動物和多種微生物(包括海洋細菌、陸生真菌和極少數的病毒)，其中細菌來源的褐藻膠裂解酶研究最為廣泛。褐藻膠裂解酶不僅具有重要的理論研究價值，還可用于制備系列不飽和褐藻膠寡糖、生產生物乙醇及解析海藻多糖結構等，因而是高效的工具酶資源。根據酶對底物的選擇性，通常可將褐藻膠裂解酶分為M專一性、G專一性、以及M/G兼性等三大類；根據酶的底物降解模式，又可以分為內切酶、外切酶等兩種基本類型。

銅綠假單胞菌是常見的機會致病菌，其粘性菌在宿主肺部產生褐藻多糖，這些褐藻多糖在囊性纖維化(CF)患者肺部形成生物膜，具有一定黏性和致密性，導致患者呼吸困難，并導致對抗生素的耐藥性。褐藻膠裂解酶可分解這種菌體生物膜中的褐藻膠成分，從而恢復病原菌對抗生素的敏感性。銅綠假單胞菌和棕色固氮菌均能合成并分泌含乙酰化甘露糖醛酸的褐藻膠，且乙酰化的褐藻膠是銅綠假單胞菌的重要致病因子。在已有報道中能以乙酰化褐藻膠為底物的裂解酶較少(LXiao etal.,2006)，有望用于囊性纖維化疾病的輔助治療。