[發(fā)明專利]褐藻膠裂解酶在制備系列寡糖產(chǎn)物中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710651814.5
• 申請(qǐng)日: 2017-08-02
• 公開（公告）號(hào): CN107574196B
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓文君;程媛媛;王丹丹;李俊鴿;王延輝;李福川;李新;衛(wèi)潔
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 濟(jì)南悟通生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12P19/02
• 分類號(hào): C12P19/02;C12P19/00;C12P19/04;C12P19/12;A61K31/702;A61K31/7016;A61K31/734;A61K31/7004;A61P11/00;A61P1/00
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

本發(fā)明涉及基因工程重組型褐藻膠裂解酶在制備系列寡糖產(chǎn)物中的應(yīng)用。M?專一性褐藻膠裂解酶在降解底物生成系列不飽和寡糖產(chǎn)物中的應(yīng)用；所述重組褐藻膠裂解酶為褐藻膠裂解酶Pae?rEAlgL，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者，所述重組褐藻膠裂解酶為褐藻膠裂解酶Avi?rEAlgL，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。褐藻膠裂解酶Pae?rEAlgL和Avi?rEAlgL是M專一性的內(nèi)切型褐藻膠裂解酶，是一種高效的制備富G段寡糖的工具酶。褐藻膠裂解酶Pae?rEAlgL和Avi?rEAlgL具有適冷特性和廣泛的pH穩(wěn)定性，有望成為用于治療囊性纖維病的酶制劑。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及褐藻膠裂解酶在制備系列寡糖產(chǎn)物中的應(yīng)用，特別涉及兩種甘露糖醛酸(M)專一性的重組褐藻膠裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL在降解由M和古羅糖醛酸(G)混合組成的商品化褐藻膠多糖制備不飽和二糖、不飽和三糖、不飽和四糖、不飽和五糖、不飽和六糖和不飽和七糖的系列寡糖產(chǎn)物中的應(yīng)用，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

褐藻膠(Alginate)與瓊膠，卡拉膠并稱三大海洋多糖。褐藻膠的主鏈?zhǔn)怯搔?D-1,4-甘露糖醛酸(Mannuronate,M)及其C-5差向異構(gòu)體α-L-1,4-古羅糖醛酸(Guluronate,G)兩種糖單元通過β-1,4糖苷鍵鏈接而成的線性多糖分子。其中，由連續(xù)的M糖單元組成的糖鏈稱為聚M段(M block)，連續(xù)的G糖單元組成的糖鏈稱為聚G段(G block)，不同的糖單元交替鏈接稱為MG或GM段(MG blocks)。褐藻膠廣泛存在于海帶，巨藻和馬尾藻等大型藻類的細(xì)胞壁和胞間質(zhì)中。某些微生物，如銅綠假單胞菌和棕色固氮菌，也能合成并分泌褐藻膠。與海藻來源的褐藻膠不同，細(xì)菌所分泌的褐藻膠在糖單元的O-2或O-3位具有一定程度的乙酰基修飾。褐藻膠無毒無害，具有良好的吸水成膠能力，是良好的支撐材料，因而廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥和食品行業(yè)。研究還表明，褐藻膠寡糖具有重要生物活性，如抗凝血、降血糖、降血脂、抗自由基、抗腫瘤、免疫保護(hù)、促植物生長等。深入研究表明：(1)聚M段和MG段可激活單核細(xì)胞，使其產(chǎn)生腫瘤壞死因子TNF-A、IL-1與IL-6，因而具有抗腫瘤活性；(2)耿美玉等以聚M段褐藻膠寡糖為原料，研制的一類候選藥物971，具有抗β-淀粉樣蛋白聚集活性，可用于治療阿爾茲海默癥；(3)聚G段寡糖是掌狀海帶的免疫激發(fā)子，能促進(jìn)海帶幼苗生長、提高海帶抗病力，預(yù)防海帶疾病。近年來，褐藻膠寡糖成為一種新的潛在的功能產(chǎn)品不斷受到人們的關(guān)注，其高值化研究已經(jīng)成為新的熱點(diǎn)。

褐藻膠裂解酶是一類多糖裂解酶(Polysaceharide Lyase,PL)，通過β消去反應(yīng)催化褐藻膠分子內(nèi)相鄰糖單元之間1,4-O-糖苷鍵的斷裂，并在寡糖產(chǎn)物中新產(chǎn)生的非還原端的糖單元的C4和C5位形成不飽和雙鍵。為區(qū)別于飽和的糖單元M和G，通常將這一不飽和的糖單元稱為Δ。這使得：(1)寡糖產(chǎn)物在235nm附近具有特征吸收；(2)不飽和糖單元的存在增加了寡糖產(chǎn)物的脂溶性。相比化學(xué)法(酸、堿、氧化)降解或者物理法(微波、超聲)降解，褐藻膠寡糖的酶法降解，具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定而明確、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)。褐藻膠裂解酶主要來源于海洋藻類、海洋軟體動(dòng)物、棘皮動(dòng)物和多種微生物(包括海洋細(xì)菌、陸生真菌和極少數(shù)的病毒)，其中細(xì)菌來源的褐藻膠裂解酶研究最為廣泛。褐藻膠裂解酶不僅具有重要的理論研究價(jià)值，還可用于制備系列不飽和褐藻膠寡糖、生產(chǎn)生物乙醇及解析海藻多糖結(jié)構(gòu)等，因而是高效的工具酶資源。根據(jù)酶對(duì)底物的選擇性，通?？蓪⒑衷迥z裂解酶分為M專一性、G專一性、以及M/G兼性等三大類；根據(jù)酶的底物降解模式，又可以分為內(nèi)切酶、外切酶等兩種基本類型。

銅綠假單胞菌是常見的機(jī)會(huì)致病菌，其粘性菌在宿主肺部產(chǎn)生褐藻多糖，這些褐藻多糖在囊性纖維化(CF)患者肺部形成生物膜，具有一定黏性和致密性，導(dǎo)致患者呼吸困難，并導(dǎo)致對(duì)抗生素的耐藥性。褐藻膠裂解酶可分解這種菌體生物膜中的褐藻膠成分，從而恢復(fù)病原菌對(duì)抗生素的敏感性。銅綠假單胞菌和棕色固氮菌均能合成并分泌含乙?；事短侨┧岬暮衷迥z，且乙?；暮衷迥z是銅綠假單胞菌的重要致病因子。在已有報(bào)道中能以乙?；衷迥z為底物的裂解酶較少(LXiao etal.,2006)，有望用于囊性纖維化疾病的輔助治療。