[發明專利]鴨腸炎病毒和鴨肝炎病毒快速檢測的探針引物組及其方法

在審

• 申請號: 201710651511.3
• 申請日: 2017-08-02
• 公開（公告）號: CN107287352A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 袁小遠;楊金興;王永明;艾武;王友令;亓麗紅
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院家禽研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所37218
• 代理人: 李桂存

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種鴨腸炎病毒和鴨肝炎病毒快速檢測的探針引物組及其方法。

背景技術

鴨腸炎病毒（Duck Enteritis virus，DEV）屬于皰疹病毒科皰疹病毒屬，病毒粒子呈球形，直徑為120～180nm，有囊膜，病毒核酸型為DNA。DEV可引起鴨、鵝等水禽的一種急性敗血性傳染病，發病率和死亡率都甚高，是危害養鴨業的最為嚴重的傳染病之一。鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DHV)是由鴨肝炎病毒引起雛鴨的一種高度致死性傳染病。該病主要感染4周齡以內的雛鴨。引起鴨肝炎的病原主要有3個血清型，Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，這三個血清型相互獨立，無交叉免疫性。

熒光定量PCR技術是通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時監控反應過程。隨著PCR反應的進行，反應產物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一次熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化，結合相應的軟件分析，可以得到熒光擴增曲線，計算待測樣品初始模板的量。當在熒光定量PCR檢測系統中引入內參基因同時與目的基因檢測，計算出一個待測樣本中目標核酸序列與校正樣本中同一序列表達的相對變化。研發一種能夠同時檢測鴨腸炎病毒和鴨肝炎病毒且簡單的方法具有重要意義。

發明內容

本發明提供了一種鴨腸炎病毒和鴨肝炎病毒快速檢測的探針引物組。

本發明還提供了一種利用上述探針引物組進行鴨腸炎病毒和鴨肝炎病毒快速檢測的方法。

本發明為了實現上述目的所采用的技術方案為：

本發明提供了一種鴨腸炎病毒和鴨肝炎病毒快速檢測的探針引物組，所述探針引物組包括檢測鴨腸炎病毒的特異性引物及探針、檢測型鴨肝炎病毒的特異性引物及探針；

所述檢測鴨腸炎病毒的特異性引物及探針序列為：

DEV-PF，如SEQ ID NO:1所示，具體序列為：5^，-ACGGTTTGTTCTATCGCTAA-3^，；

DEV-PR，如SEQ ID NO:2所示，具體序列為：5^，-TAGGTTGTGGTTGAATTGGT-3^，；

DEV-Probe，如SEQ ID NO:3所示，具體序列為：5^，-FAM-CATGGTAAGCGTATTGTTCA-MGB-3^，；

所述檢測型鴨肝炎病毒的特異性引物及探針的序列為：

DHV-PF，如SEQ ID NO:4所示，具體序列為：5^，-TGCTGTCCTTTCTATCAATG-3^，；

DHV-PR，如SEQ ID NO:5所示，具體序列為：5^，-TTGTCAGATGCTTTCTTAGC-3^，；

DHV-Probe，如SEQ ID NO:6所示，具體序列為：5^，-FAM-CCAGCGACTTGGAGTGAAGA-MGB-3^，。

本發明還提供了一種利用上述鴨腸炎病毒和鴨肝炎病毒快速檢測探針引物組進行檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）設計引物及探針；

（2）分別提取待測樣品RNA和DNA，將RNA進行RT反應得cDNA；

（3）以cDNA和DNA為模板進行實時定量熒光PCR反應。

進一步的，所述RT反應體系為：10mM dNTP 1μL、5×RT緩沖液4.0μL、10 μM Oligo dT 1μL、RNase Inhibitor（40U/μL）0.5μL、RNA模板100pg～1μg、RTase（200U/μL）1μL。

進一步的，所述RT反應的過程為：42℃ 25min，95℃ 2min，得到的cDNA 置于-20℃保存。

本發明所使用的實時定量熒光PCR反應：當使用DEV引物時，反應體系包括DHV cDNA和DEV DNA各自1μL、2×PCR MIX(QIAGEN) 8μL、Primer(DEV-PF 50pM/μL) 0.2μL、Primer(DEV-PR 50pM/μL) 0.2μL、DEV-Probe(50pM/μL) 0.1uL、H2O 5.5μL，總體系16μL；