[發(fā)明專利]鴨腸炎病毒和鴨肝炎病毒快速檢測的探針引物組及其方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710651511.3
• 申請日: 2017-08-02
• 公開（公告）號: CN107287352A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁小遠(yuǎn);楊金興;王永明;艾武;王友令;亓麗紅
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所37218
• 代理人: 李桂存

1.一種鴨腸炎病毒和鴨肝炎病毒快速檢測的探針引物組，其特征在于，所述探針引物組包括檢測鴨腸炎病毒的特異性引物及探針、檢測型鴨肝炎病毒的特異性引物及探針；

所述檢測鴨腸炎病毒的特異性引物及探針序列為SEQ ID NO：1-3所示，具體為：

DEV-PF ：5^，-ACGGTTTGTTCTATCGCTAA-3^，；

DEV-PR：5^，-TAGGTTGTGGTTGAATTGGT-3^，；

DEV-Probe：5^，-FAM-CATGGTAAGCGTATTGTTCA-MGB-3^，；

所述檢測型鴨肝炎病毒的特異性引物及探針的序列SEQ ID NO：4-6所示，具體為：

DHV-PF：5^，-TGCTGTCCTTTCTATCAATG-3^，；

DHV-PR：5^，-TTGTCAGATGCTTTCTTAGC-3^，；

DHV-Probe：5^，-FAM-CCAGCGACTTGGAGTGAAGA-MGB-3^，。

2.一種利用如權(quán)利要求1所述的探針引物組進(jìn)行檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）設(shè)計(jì)引物及探針；

（2）分別提取待測樣品RNA和DNA，將RNA進(jìn)行RT反應(yīng)得cDNA；

（3）以cDNA和DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR反應(yīng)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述RT反應(yīng)體系為：10mM dNTP 1μL、5×RT緩沖液4.0μL、10 μM Oligo dT 1μL、RNase Inhibitor（40U/μL）0.5μL、RNA模板100pg～1μg、RTase（200U/μL）1μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述RT反應(yīng)的過程為：42℃ 25min，95℃ 2min，得到的cDNA 置于-20℃保存。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)定量熒光PCR反應(yīng)：當(dāng)使用DEV引物時(shí)，反應(yīng)體系包括DHV cDNA和DEV DNA各自1μL、2×PCR MIX(QIAGEN) 8μL、Primer(DEV-PF 50pM/μL) 0.2μL、Primer(DEV-PR 50pM/μL) 0.2μL、DEV-Probe(50pM/μL) 0.1uL、H2O 5.5μL，總體系16μL；

當(dāng)使用DHV引物時(shí)，反應(yīng)體系包括DHV cDNA和DEV DNA各自1μL、2×PCR MIX(QIAGEN) 8μL、 Primer(DHV-PF 50pM/μL) 0.2μL、Primer(DHV-PR 50pM/μL) 0.2μL、DHV-Probe(50pM/μL) 0.1uL、 H2O 5.5μL，總體系16μL。

6. 根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)定量熒光PCR反應(yīng)的過程為：95℃2min，隨后94℃10s、59℃10s、72℃40s 共進(jìn)行40cycles。