[發(fā)明專利]一種二氫硫辛酰胺脫氫酶突變體蛋白及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710650938.1
• 申請日: 2017-08-02
• 公開（公告）號: CN107267474B
• 公開（公告）日: 2020-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳晶瑜;孟嬌
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/62
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;何葉喧

本發(fā)明公開了一種二氫硫辛酰胺脫氫酶突變體蛋白及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)(IAA350/351/358VVV突變體蛋白)，為將二氫硫辛酰胺脫氫酶進(jìn)行點(diǎn)突變甲和點(diǎn)突變乙和點(diǎn)突變丙得到的蛋白質(zhì)；點(diǎn)突變甲為將二氫硫辛酰胺脫氫酶第350位氨基酸殘基由I突變?yōu)閂；點(diǎn)突變乙為將二氫硫辛酰胺脫氫酶第351位氨基酸殘基由A突變?yōu)閂；點(diǎn)突變丙為將二氫硫辛酰胺脫氫酶第358位氨基酸殘基由A突變?yōu)閂。本發(fā)明提供的突變體蛋白，對NADH抑制的敏感性降低，使得PDH在厭氧大腸桿菌培養(yǎng)物中對NADH的耐受性增加，能有效提高PDH的活性。本發(fā)明對于大腸桿菌生產(chǎn)琥珀酸鹽、乙醇、丁醇、1,3?丙二醇等還原化學(xué)物質(zhì)具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種二氫硫辛酰胺脫氫酶突變體蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

大腸桿菌，兼性異養(yǎng)，在有氧和無氧條件下均能生長。丙酮酸脫氫酶(PDH)又稱丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(PDHC)，位于線粒體中，控制著碳水化合物利用的關(guān)鍵步驟，即丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A和NADH。PDH的三個組分由單個操縱子編碼，該操縱子包括調(diào)節(jié)基因(pdhR)和三個結(jié)構(gòu)基因，三個結(jié)構(gòu)基因?yàn)閍ceE基因(編碼丙酮酸脫氫酶E1)、aceF基因(編碼二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶E2)和lpd基因(編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶E3)。在厭氧條件下，大腸桿菌的細(xì)胞提取物中能檢測到PDH活性，然而，大腸桿菌體內(nèi)的PDH通常是無活性的。在有氧生長期間，糖酵解中產(chǎn)生的NADH最終被氧化，而在糖酵解過程中由葡萄糖產(chǎn)生的有機(jī)化合物用作電子受體，以維持氧化還原平衡，并且在厭氧條件下持續(xù)細(xì)菌的生長。由于兩種生長模式之間的電子受體的差異，厭氧細(xì)胞所報(bào)導(dǎo)的[NADH]/[NAD⁺]比值遠(yuǎn)高于好氧細(xì)胞的比值。由于NADH的抑制，厭氧大腸桿菌培養(yǎng)物中的PDH活性非常低或檢測不到其活性。進(jìn)一步的研究已經(jīng)證實(shí)，PDH的NADH敏感性位于二氫硫辛酰胺脫氫酶(Dihydrolipoamide dehydrogenase,Lpd)中，因?yàn)橹挥羞@種酶與NAD⁺作為底物相互作用。

工業(yè)發(fā)酵旨在有氧或厭氧的條件下，微生物利用便宜的原料生產(chǎn)有價值的產(chǎn)品。在厭氧發(fā)酵過程中，還原力NADH主要集中于產(chǎn)物的合成而不是被氧化，從而導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量更高。例如，乳酸和琥珀酸等有機(jī)酸，二者均能通過厭氧發(fā)酵有效地產(chǎn)生。然而，乳酸和琥珀酸的最大理論得率均受NADH供應(yīng)的限制。這是因?yàn)椋涸趨捬鯒l件下，由于PDH的活力受到抑制，1摩爾的葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑僅能提供2摩爾的NADH；然而在好氧條件下，1摩爾的葡萄糖可以產(chǎn)生4摩爾的NADH?？梢?，足夠還原力的供應(yīng)對于獲得目標(biāo)產(chǎn)物的最大理論得率是至關(guān)重要的。PDH催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，同時伴隨一分子NADH的生成。如果PDH酶被激活，NADH的可利用度就可以得到改善，導(dǎo)致代謝通路中NADH依賴型的產(chǎn)品的產(chǎn)量增加。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種二氫硫辛酰胺脫氫酶突變體蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)(IAA350/351/358VVV突變體蛋白)，為如下(a1)或(a2)：

(a1)將二氫硫辛酰胺脫氫酶進(jìn)行點(diǎn)突變甲和點(diǎn)突變乙和點(diǎn)突變丙得到的蛋白質(zhì)；所述點(diǎn)突變甲為將二氫硫辛酰胺脫氫酶第350位氨基酸殘基由I突變?yōu)閂；所述點(diǎn)突變乙為將二氫硫辛酰胺脫氫酶第351位氨基酸殘基由A突變?yōu)閂；所述點(diǎn)突變丙為將二氫硫辛酰胺脫氫酶第358位氨基酸殘基由A突變?yōu)閂；

(a2)在(a1)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)。

所述標(biāo)簽見表1。

表1標(biāo)簽的序列