[發明專利]一種外酶C3轉移酶基因治療藥物及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201710650662.7
• 申請日: 2017-08-02
• 公開（公告）號: CN107375947A
• 公開（公告）日: 2017-11-24
• 發明（設計）人: 王寧利;劉旭陽;王云
• 申請（專利權）人: 王寧利;劉旭陽
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K38/45;A61P27/06;A61P27/02;A61P25/00
• 代理公司: 北京高航知識產權代理有限公司11530
• 代理人: 趙永強

技術領域

本發明涉及基因治療藥物技術領域，具體地，涉及一種外酶C3轉移酶基因治療藥物及其制備方法和應用。

背景技術

青光眼是一種以眼壓升高為主要危險因素，以視網膜神經節細胞(retinal ganglion cell，RGC)凋亡為病理基礎的視神經病變。傳統的青光眼治療方法主要是降低眼壓，但臨床實踐證明，僅用降眼壓方法不足以治療該病。一些青光眼患者經藥物或手術治療控制眼壓后，其視野損害仍在進一步加重。而正常眼壓性青光眼眼壓雖在相對正常范圍，但視功能卻仍然進行性受損，表明降眼壓固然重要，但不能完全中斷青光眼性視神經損害的病理進程，如RGC凋亡和神經纖維丟失。因此，降眼壓聯合干預RGC凋亡(即神經保護)的方法才是治療青光眼的理想途徑。

Rho GTP酶(Rho GTPases，Rho)是GTP結合蛋白，單體分子量為20-30kDa，屬于Ras超家族成員，作為分子開關(molecular switch)參與多項細胞活動的調節，如細胞骨架、細胞粘連、分泌內吞、細胞周期及細胞凋亡等。近年來，有研究顯示Rho通路在調節NMDA介導的神經興奮性毒性中有重要作用。在大鼠海馬神經元中RhoA調節NMDA受體的功能；并且NMDA引起Ca²⁺內流能激活Rho的活性，進一步激活p38α引發神經元凋亡。同時有報道顯示Rho下游分子ROCK的抑制劑H-1152P和Rho激酶抑制劑fasudil分別在視神經擠壓損傷(optic nerve crush)模型和興奮性毒性損傷模型中能促進RGC的存活，具有神經保護作用。因此，抑制Rho及其下游分子ROCK可成為青光眼治療中神經保護的重要途徑。外酶C3轉移酶(Exoenzyme C3 Transferase，C3)是從肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridium botulinum)中分離出來的特異性Rho抑制劑。其抑制機理是使Rho核糖基化而失去功能。據文獻報道，在視神經擠壓損傷動物模型中經C3處理后，可增加RGC的存活和軸突的再生。然而，關于C3在青光眼性視神經損傷中的保護作用國內外罕有文獻報道。

實驗結果證實C3能有效的保護RGC，減輕由NMDA引起的神經毒性，具有神經保護作用。但由于C3蛋白作為外源性蛋白，易被眼內水解酶降解，其作用僅能維持3天。如需反復玻璃體注射給藥則失去臨床實用意義。

因此，如果能開發一種同時兼顧視神經保護和降眼壓藥物，將會對青光眼預防與治療具有重要的意義。

發明內容

本發明針對現有技術的上述不足，提供了一種外酶C3轉移酶(Exoenzyme C3Transferase，C3)基因治療藥物及其制備方法和應用。

為了實現上述目的，本發明是通過以下方案予以實現的：

發明人課題組前期研究結果顯示C3轉移酶基因能顯著影響人小梁網細胞的肌動蛋白纖維、細胞骨架和細胞粘附，增加房水流出，從而起到降眼壓的作用；C3轉移酶基因序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一種外酶C3轉移酶基因治療藥物，包括C3基因通過與病毒載體構建重組載體，所述重組載體通過病毒包裝獲得C3轉移酶基因治療藥物。

優選地，所述病毒載體包括慢病毒載體(Lentivirus，LV)或者腺相關病毒載體Adeno-associated virus(AAV)。

更優選地，所述慢病毒載體為LV病毒載體pLvx-MCMV-ZsGreen。

外酶C3轉移酶基因在制備眼部神經保護藥物或者降眼壓藥物中的應用。

外酶C3轉移酶基因在制備青光眼預防藥物或治療藥物中的應用。

一種外酶C3轉移酶基因治療藥物制備方法，包括以下步驟：

S1.根據C3基因序列設計擴增引物，并且在上下游引物分別引入合適的酶切位點；

S2.使用上述步驟設計的引物，PCR擴增目的基因；

S3.目的基因與病毒質粒構建重組質粒；

S4.陽性重組質粒篩選驗證；

S5.陽性重組質粒進行病毒包裝，獲得外酶C3轉移酶基因治療藥物。

優選地，所述上游引物引入的酶切位點為EcoR I；所述下游引物引入酶切位點為BamH I。

優選地，所述擴增引物為：

上游引物：5'-CGGAATTCATGGCTTATTCCATTAATCAAAAGGC-3'；

下游引物：5'-CGGGATCCTTATTTAGGATTGATAGCTGTGC-3'。