[發明專利]一種用于染色體異常檢測的文庫構建方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201710650277.2
• 申請日: 2017-08-01
• 公開（公告）號: CN107217310A
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發明（設計）人: 洪燕;白金蕾;玄兆伶;李大為;梁峻彬;陳重建
• 申請（專利權）人: 安諾優達基因科技（北京）有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于基因檢測領域，具體涉及一種適于少量樣本的用于染色體異常檢測的測序用文庫構建方法及試劑盒。

背景技術

染色體是細胞核中的遺傳物質，人類有23對染色體，其中22對為常染色體，1對為性染色體。染色體異常包括染色體結構異常和數目異常，由染色體異常導致的疾病，臨床上表現為染色體病，在自發性流產、死胎、早夭中占50％以上，新生兒中發病率約1％，屬于常見的出生缺陷。

染色體數目異常指多1條或數條染色體、多1條或數條染色體片段，常見的染色體數目異常為13三體、18三體及21三體。在產前診斷中，染色體異常的主要檢測技術包括：核型分析、比較基因組雜交技術(arrayCGH)、熒光原位雜交技術，但是由于羊水或臍帶血中胎兒遺傳物質較少，需要對遺傳物質進行放大。如對于核型分析來說，該方法需經過細胞培養富集胎兒細胞，非常耗時耗力，病人等待報告的周期長。

近年來，隨著下一代高通量測序(Next Generation Sequencing，NGS)技術的迅速發展，由于其存在分辨率高，通量大等優勢，目前已經被廣泛應用于染色體異常的分析。通過傳統的建庫方法能夠檢測染色體異常，還可發現新變異，但該方法通常要求較高的DNA樣本起始量(100ng以上)，當采集樣本數量有限并無法獲得足量DNA時(如臨床采集又不經實驗再放大的羊水、臍血等樣本)，通過現有的建庫方法往往不能得到滿足后續測序需求的文庫產量。若可以實現不經細胞培養，而是直接利用羊水、臍血等少量樣本進行建庫并檢測染色體異常，能夠大大節約實驗時間和檢測成本，將會有很廣闊的應用前景。

發明內容

鑒于上述現有技術中存在的問題，本發明的目的在于提供一種能夠適用于羊水等少量樣本的用于染色體異常檢測的測序用文庫的構建方法及試劑盒。

本發明人為解決上述問題進行了深入研究，結果發現通過優化反應體系及反應條件，實現構建適用于羊水少量樣本的、染色體異常檢測的測序用文庫，從而完成了本發明。

即，本發明包括：

1.一種用于染色體異常檢測的文庫構建方法，該方法包括：

步驟A：提取樣本gDNA，獲得gDNA；

步驟B：將所述gDNA進行酶切處理，純化，獲得酶切產物；

步驟C：將所述酶切產物進行末端修復，純化，得到平末端DNA片段；

步驟D：將所述平末端DNA片段進行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；

步驟E：將所述3'端加A的DNA片段進行加接頭，純化，得到加接頭的DNA片段；

步驟F：將所述加接頭的DNA片段進行PCR擴增，純化，得到擴增產物；

其中，步驟B中所述的酶切處理使用的酶為dsDNA Fragmentase；

步驟C中所述末端修復使用試劑包括：1μL T4DNA聚合酶，1μL T4多聚核苷酸激酶、5μL 10×多聚核苷酸激酶緩沖液及1μL dNTP；

步驟D中所述3'端加A使用試劑包括：0.5μL Klenow片段(3'-5'exo-)、2.5μL dATP及2.5μL 10×緩沖液；

步驟F中所述PCR擴增的擴增引物包括：

Ann引物序列(SEQ ID NO:1)：

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-3'

Index引物序列(SEQ ID NO:2)：

5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATANNNNNNNGTGACTGGAGTTC-3'；

其中，N為隨機堿基。

2.根據項1所述的文庫構建方法，其中，所述步驟A中樣本為羊水、臍血、全血、組織中任意一種。

3.根據項1所述的文庫構建方法，其中，所述步驟B中gDNA的量為8～15ng。

4.根據項1所述的文庫構建方法，其中，所述步驟B的酶切處理的條件為37℃50分鐘。

5.根據項1所述的文庫構建方法，其中，所述步驟C的末端修復的條件為20℃30分鐘。

6.根據項1所述的文庫構建方法，其中，所述步驟D的3'端加A的反應條件為37℃30分鐘。

7.根據項1所述的文庫構建方法，其中，所述步驟F的PCR擴增條件為94℃預變性2分鐘、(94℃變性15秒、62℃退火30秒、72℃延伸30秒)17個循環、72℃延伸10分鐘、4℃保存。

8.一種用于染色體異常檢測的文庫構建試劑盒，其用于實施項1～7中任一項所述的文庫構建方法，其包括：