[發明專利]半滑舌鰨IGF?I蛋白及其體外表達制備方法與應用

在審

• 申請號: 201710648921.2
• 申請日: 2017-08-01
• 公開（公告）號: CN107216379A
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發明（設計）人: 徐永江;柳學周;王濱;史寶;李斌
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C07K14/46
• 分類號: C07K14/46;C12N15/12;C12N15/81
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明屬于生物基因工程技術領域，具體涉及一種半滑舌鰨IGF-I蛋白及其體外表達制備方法與應用。

背景技術

生長激素-胰島素樣生長因子軸(GH/IGF-I axis)在魚類生長發育過程中起著關鍵的生理調控作用。IGF-I是生長軸的下游調控因子，在進化上較為保守，其在硬骨魚類生長、生殖、代謝、滲透壓調節、行為、攝食和免疫等方面都具有重要的生理功能。為了促進IGF-I在魚類養殖生產中應用，科研和養殖從業者希望能將IGF-I成熟肽在體外表達生產，獲得IGF-I的蛋白產品后作為功能性生長代謝或免疫調節劑，以飼料添加劑等方式用于專用配合飼料研制。已有研究表明，重組IGF-I蛋白作為促生長或代謝調控因子，通過注射、浸泡或飼料添加的方式可有效促進養殖魚類的生長代謝，且魚類對外源重組蛋白尤其是同源的重組蛋白吸收快、代謝快,不會在體內產生累計，因而安全可靠。所以,利用基因工程表達手段獲得重組魚類類胰島素生長因子并用于養殖魚類生長調控，在水產養殖業中具有重要應用價值。目前，已利用基因工程手段在原核表達系統(大腸桿菌)中成功實現了鱸魚、羅非魚、草魚、虹鱒、大菱鲆等魚類的IGF-I體外重組表達，獲得了有生物活性的IGF-I重組蛋白，為魚類IGF-I在養殖生產中的應用奠定了基礎。但是，原核表達系統存在許多難以克服的缺點：如原核宿主菌本身可能會產生內毒素，過量表達可能會導致非生理反應；原核表達系統產生的目的蛋白常以包涵體形式表達，導致產物純化困難；原核表達系統翻譯后加工修飾體系不完善，表達產物的生物活性較低。為克服原核表達載體的不足，研究者們開發了真核表達系統，其優點是包括靶DNA與真核基因調控序列基本無同源性，避免了基因的非特異性激活或抑制；與原核表達相比，誘導基因表達效率顯著提高；嚴格調控基因表達，獲得的蛋白產物具有生物活性，無需分離、變性、復性等復雜處理過程。目前，基因工程研究中常用的真核表達系統有酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統和哺乳動物細胞表達系統。半滑舌鰨是我國重要的海水養殖經濟魚種，已成為我國鲆鰈魚類養殖產業三大主導種類之一。半滑舌鰨具有明顯的生長差異性別二態性，即雄魚生長速度較雌魚慢2-3倍，不利于產業的持續發展。如能利用具備生長代謝調控功能的基因產物來研制相應的生物制品，實現對養殖半滑舌鰨生長差異和代謝的人工調控，將會為養殖產業發展帶來巨大經濟效益，應用前景廣闊。目前，已證明IGF-I在半滑舌鰨生長發育和代謝過程中具有重要的生理調控作用，但由于尚無成熟的IGF-I蛋白產品，因而尚未在養殖生產中應用。另外，目前市場上也未見半滑舌鰨養殖專用的功能性的生長代謝調控專用添加劑。

發明內容

為了解決上述技術難題，促進IGF-I在半滑舌鰨養殖生產中的應用，本發明提供一種半滑舌鰨IGF-I蛋白的體外真核表達制備及應用方法，利用按照酵母密碼子偏好性改造過的半滑舌鰨IGF-I成熟肽序列，添加酶切位點和6×His標簽序列后與真核表達載體構建了重組表達載體，并在酵母工程菌中成功實現了IGF-I的高效表達，獲得了具有生物活性的半滑舌鰨IGF-I重組蛋白，以飼料添加劑的形式應用后具有明顯的促生長效果。

本發明通過以下技術方案實現：

一種半滑舌鰨IGF-I蛋白，所述的蛋白的核苷酸序列為SEQ IDNO:1；

一種半滑舌鰨IGF-I蛋白，所述的蛋白的氨基酸序列為SEQ IDNO:3；

本發明提供一種半滑舌鰨IGF-I蛋白的體外表達制備方法，它包括成熟肽序列改造、重組表達載體構建、重組表達載體誘導表達和重組蛋白純化；

所述的成熟肽序列改造，為了進行高效表達，對半滑舌鰨IGF-I成熟肽的核苷酸序列SEQ IDNO:1根據酵母菌的密碼子偏好性進行改造，獲得適宜在酵母菌內高效表達的核苷酸序列SEQ IDNO:2；

所述的重組表達載體構建，在目的核苷酸序列SEQ IDNO:2上添加酶切位點和His×6標簽后與真核表達載體pPICZaA進行重組，構成可表達氨基酸序列為SEQ IDNO:3的半滑舌鰨類胰島素生長因子I(IGF-I)多肽的重組表達載體pPICZaA-IGF-I。

進一步，添加酶切位點是指在目的核苷酸序列上游添加XhoI酶切位點，在下游添加XbaI酶切位點，并在目的核苷酸序列上游引入畢赤酵母蛋白酶Ste13酶切位點；

進一步，添加His×6標簽是指添加于目的核苷酸序列下游，便于表達后目的蛋白的鎳柱純化。