[發(fā)明專利]半滑舌鰨IGF?I蛋白及其體外表達(dá)制備方法與應(yīng)用在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201710648921.2 | 申請(qǐng)日： | 2017-08-01 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN107216379A | 公開（公告）日： | 2017-09-29 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 徐永江;柳學(xué)周;王濱;史寶;李斌 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 |
| 主分類號(hào)： | C07K14/46 | 分類號(hào)： | C07K14/46;C12N15/12;C12N15/81 |
| 代理公司： | 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11350 | 代理人： | 湯東鳳 |
| 地址： | 266071 山*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 舌鰨 igf 蛋白 及其 體外 表達(dá) 制備 方法 應(yīng)用 | ||
1.一種半滑舌鰨IGF-I蛋白，其特征在于所述半滑舌鰨IGF-I蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO:1。
2.權(quán)利要求1所述的一種半滑舌鰨IGF-I蛋白，其特征在于所述半滑舌鰨IGF-I蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:3。
3.權(quán)利要求1所述半滑舌鰨IGF-I蛋白的體外表達(dá)制備方法，其特征在于它包括成熟肽序列改造、重組表達(dá)載體構(gòu)建、重組表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)和重組蛋白純化；
所述的成熟肽序列改造，對(duì)半滑舌鰨IGF-I成熟肽的核苷酸序列SEQ ID NO:1根據(jù)酵母菌的密碼子偏好性進(jìn)行改造，獲得適宜在酵母菌內(nèi)高效表達(dá)的核苷酸序列SEQ ID NO:2；
所述的重組表達(dá)載體構(gòu)建，在目的核苷酸序列SEQ ID NO:2上添加酶切位點(diǎn)和His×6標(biāo)簽后與真核表達(dá)載體pPICZaA進(jìn)行重組，構(gòu)成可表達(dá)氨基酸序列為SEQ ID NO:3的半滑舌鰨類胰島素生長因子I多肽的重組表達(dá)載體pPICZaA-IGF-I；
所述的重組表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)，將重組表達(dá)載體線性化，電轉(zhuǎn)導(dǎo)入處于化學(xué)感受態(tài)的表達(dá)菌株P(guān)ichia pastoris X33，形成重組表達(dá)菌株pPICZaA-IGF-I-Pichia pastoris X33，挑選高效表達(dá)的陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，并利用甲醇誘導(dǎo)重組表達(dá)菌分泌表達(dá)目的蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的重組表達(dá)載體構(gòu)建步驟中所述添加酶切位點(diǎn)是指在目的核苷酸序列上游添加XhoI酶切位點(diǎn)，在下游添加XbaI酶切位點(diǎn)，并在目的核苷酸序列上游引入畢赤酵母蛋白酶Ste13酶切位點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的重組表達(dá)載體構(gòu)建步驟中添加His×6標(biāo)簽是指添加于目的核苷酸序列下游。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的重組表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)具體方法為取線性化的重組表達(dá)載體pPICZaA-IGF-I加入處于化學(xué)感受態(tài)的表達(dá)菌株P(guān)ichia pastoris X33，置于電轉(zhuǎn)杯內(nèi)，冰上放置6分鐘后，利用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)化，同時(shí)加入山梨醇，將電轉(zhuǎn)后的液體轉(zhuǎn)入離心管中30℃靜止1.5h，然后轉(zhuǎn)入YPD培養(yǎng)基中培育2h，培育條件：30℃，200rpm搖動(dòng)，然后，涂布YPD平板，培養(yǎng)；
挑選平板培養(yǎng)的陽性克隆，以BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)，30℃200rpm，然后收集菌體利用BMMY培養(yǎng)至OD值至1.0時(shí)，加入甲醇誘導(dǎo)重組表達(dá)菌株分泌表達(dá)目的蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述甲醇誘導(dǎo)濃度為0.5％。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)的條件為：溫度為30℃，pH為5.0，誘導(dǎo)時(shí)間為36h。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的重組蛋白純化，是指將培養(yǎng)的半滑舌鰨IGF-I重組表達(dá)酵母菌上清液以硫酸銨沉淀后再溶解，上清液經(jīng)過微濾膜過濾后經(jīng)過濾柱掛柱，再以洗脫液洗脫后即可得到純化的目的蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述的硫酸銨濃度為350mg/L、微濾膜孔徑為0.45μm。
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