[發明專利]單細胞高效捕獲、高內涵成像和全轉錄組分析裝置和方法

在審

• 申請號: 201710648869.0
• 申請日: 2017-08-01
• 公開（公告）號: CN107389642A
• 公開（公告）日: 2017-11-24
• 發明（設計）人: 趙亮;陳甘雨;劉楊;張學記
• 申請（專利權）人: 北京科技大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/533;G01N33/574;G01N33/50;C12M1/00;C12N5/00
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司11401
• 代理人: 皋吉甫

技術領域

本發明屬于單細胞捕獲、分析技術領域，具體涉及單細胞高效捕獲、高內涵成像和全轉錄組分析裝置和方法。

背景技術

高通量監測單細胞響應，對于藥物測試，毒理學和基本細胞生物學等各種應用是非常重要的。最近的研究強調了跨越癌細胞群體的基因組，轉錄組和蛋白質組中的顯著異質性，表征這種異質性對于理解腫瘤進展至關重要。單細胞分析對重大疾病早期診斷、治療、藥物篩選和細胞生理、病理過程的研究有重要意義，目前已成為研究的熱點之一。

1980 年代初發展起來的毛細管電泳(CE) 分離方法因其進樣體積小、分離效率高、分離速度快等優點，適于對多種組分的測定和定量，已用于單細胞多組分的檢測，取得了一些成果。但受毛細管一維結構的限制，單細胞進樣和溶膜操作復雜。以傳統的流式細胞儀為代表的細胞計數和篩選儀器，雖已實現集成化和自動化，但同樣具有儀器體積大、內部結構復雜、易損壞等缺點。

微流控芯片是推動單細胞分析的又一重要工具。近年來基于微流控技術的單細胞分析，由于其靈敏度和高通量的優勢，為研究生物系統的異質性提供了一個非常強大的工具。目前已有文獻報道利用微井陣列的方法進行細胞成像的分析（Huang,L.; Chen, Y.; Chen, Y.; Wu,H. Anal. Chem. 2015, 87, 12169?12176）。不過該方法雖然能夠分析單細胞的熒光成像信號，卻難以將單細胞回收之后進行后續的分子生物學分析，特別是轉錄組的分析。另外，也有研究論文和專利 (Tang, Y.; Wang,Z.; Li, Z.; Kim, J.; Deng, Y.; Li, Y.; Heath, J. R.; Wei, W.; Lu, S.; Shi, Q. Proc Natl Acad Sci USA. 114: 2544–2549;專利號:CN105954246 A)報道了基于微井陣列可尋址地捕獲稀有的體液中的腫瘤細胞。不過，該方法適用范圍是體液中的稀有腫瘤細胞，另外，每個單獨的微井中不止含有一個細胞，這為單細胞的圖像分析帶來了困難，也沒有展示出RNA測序分析的可能性。

因此，目前報道的利用微流控技術進行單細胞分析的方法不能實現將單細胞的高通量成像表征和全轉錄組分析結合起來，因而在研究細胞表型與基因型的相關性方面存在缺陷。迫切需要一種能從全轉錄組水平上探索單細胞間異質性的裝置和方法。

發明內容

針對上述技術問題，本發明提供一種單細胞高效捕獲、高內涵成像和全轉錄組分析裝置和方法。本發明所述單細胞高通量捕獲裝置能夠快速高效地捕獲細胞，本發明還提供一種單細胞高內涵成像的方法，該方法利用單細胞高通量捕獲裝置，高通量獲取單細胞的圖像信息，本發明還提供一種定位挑取單細胞的方法，該方法利用單細胞高通量捕獲裝置，定位挑取單細胞能夠用于單細胞的全轉錄組分析。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種單細胞高通量捕獲的裝置，所述裝置用于捕獲單細胞，所述裝置包括聚二甲基硅氧烷微井陣列芯片和細胞培養板或細胞培養皿基底；所述微井陣列芯片貼合于所述細胞培養板基底或所述細胞培養皿基底上，對所述細胞培養板基底或所述細胞培養皿基底的表面不做處理。

進一步地，所述微井陣列芯片上分布有微井，所述微井的直徑為23 μm±5μm，深度為25±10 μm，任意兩個相鄰微井的圓心距為46 μm±10 μm。

進一步地，所述微井陣列芯片的制作方法為：利用光刻蝕技術制作出包含微柱陣列的模具，然后將聚二甲基硅氧烷直接澆灌在所述模具上，固化后分離模具，得到所述聚二甲基硅氧烷微井陣列芯片。

進一步地，所述細胞培養板基底或所述細胞培養皿基底為玻璃、硅片、金屬或高分子材料。

一種單細胞高通量捕獲的方法，包括以下步驟：

步驟一、使用膠帶粘除聚二甲基硅氧烷微井陣列芯片底面的灰塵，將其切割成合適的形狀和大小后，緊貼放置于細胞培養板基底或細胞培養皿基底上，獲得單細胞高通量捕獲裝置；

步驟二、將所述聚二甲基硅氧烷微井陣列芯片進行浸潤處理以提高其表面親水性；

步驟三、制備細胞的懸浮溶液并注入所述聚二甲基硅氧烷微井陣列芯片的上部，靜置或離心，將單細胞捕獲入微井中；

步驟四、用PBS溶液洗去所述聚二甲基硅氧烷微井陣列芯片表面多余的細胞。