[發明專利]基于體外反應體系篩選黃曲霉SUMO化靶蛋白的方法

有效

• 申請號: 201710647254.6
• 申請日: 2017-08-01
• 公開（公告）號: CN107389945B
• 公開（公告）日: 2019-02-22
• 發明（設計）人: 聶鑫怡;李玲;岳躍威;汪世華
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C40B50/06
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明涉及基于體外反應體系篩選黃曲霉SUMO化靶蛋白的方法，該體系由SUMO化反應溶液體系組成，其中包含了原核表達的黃曲霉SUMO化酶系中的修飾分子AfSumO，SUMO E1活化酶AfAosA?AfUbaB，SUMO E2結合酶AfUbcI，SUMO E3連接酶以及待檢測的蛋白或藥物。利用該體系一方面可以快速鑒定/篩選影響黃曲霉SUMO化修飾過程的藥物分子或小分子化合物；同時利用該體系在體外方便快速的檢測某種蛋白是否能被黃曲霉的SUMO化體系修飾，進而鑒定/篩選潛在的SUMO化靶標蛋白。

技術領域

本發明屬于微生物學領域和生物技術領域，具體涉及基于體外反應體系篩選黃曲霉SUMO化靶蛋白的方法。

背景技術

許多可逆的翻譯后修飾如磷酸化、糖基化、泛素化、SUMO（small ubiquitin-related modifier）化等，被認為可能是聯接遺傳背景、環境因子兩大因素的重要橋梁之一，介導兩者的復雜交互作用，最終影響生物的性狀。作為一種非常重要的蛋白翻譯后修飾，SUMO化修飾可能會影響靶蛋白的穩定性、細胞定位和蛋白活性。SUMO蛋白首先在釀酒酵母里被發現，SUMO化過程和泛素化過程很類似。首先由E1活化酶Aos1-Uba2活化SUMO，之后由E1轉移到E2結合酶Ubc9的Cys殘基上，最后Ubc9在E3連接酶的幫助下把SUMO轉移到靶蛋白的Lys殘基上，完成SUMO化修飾。目前已知SUMO化的E1和E2都是唯一的，但E3酶一般有多個，不同的E3具有不同的底物特異性。

目前國內外對SUMO化修飾的研究正開展得如火如荼，但曲霉屬的生物只有構巢曲霉和黃曲霉（Aspergillus flavus）有相關報道。我們在黃曲霉中發現AfsumO基因，證明黃曲霉存在SUMO化修飾，且該修飾對黃曲霉對環境壓力的應答、產孢量、菌核數、產毒和侵染種子的致病性都有顯著影響。但目前還未在黃曲霉中發現SUMO化的靶標蛋白，SUMO化修飾對黃曲霉生長發育和產毒的調控機制還是未知的。因此，篩選SUMO化靶標蛋白，分析這些靶標蛋白的調控網絡，對研究SUMO化修飾對黃曲霉生長發育和產毒的調控機制是很有幫助的。然而黃曲霉是多細胞的絲狀真菌，利用已有的遺傳操作手段在其體內篩選、驗證SUMO化靶標蛋白難度較大。

依據現有相關資料分析，目前SUMO化靶標蛋白的篩選方法主要是利用針對SUMO的免疫共沉淀、串聯親和純化等手段，直接分析真核細胞/組織裂解物中的帶有SUMO蛋白的復合物，利用質譜分析復合物中的SUMO化靶標蛋白，其難度和缺陷主要在于：1、SUMO化修飾本身是一個雙向的、動態、具有時空性的過程，即靶標蛋白攜帶SUMO修飾的過程是不穩定的（SUMO化靶標蛋白會被SUMO化特異蛋白酶催化發生去SUMO化），因此現有的直接分析真核細胞/組織裂解物中的SUMO化靶標的方法其分析的SUMO化蛋白的信息是一個瞬時的信息，許多發生去SUMO化的蛋白無法被篩選分析；2、真核細胞中各種蛋白的豐度是不平均的，現有的針對蛋白質的分析手段，極有可能丟失一些低豐度蛋白的信息；3、目前的質譜技術雖然技術精度越來越高，但最終的蛋白鑒定仍基于蛋白數據庫的分析，這對一些遺傳背景不清晰的非模式生物來說，最終蛋白鑒定的成功率和準確性可能會受到限制，對一些同源比對得分不高即無法鑒定的蛋白，不能進行進一步分析。