[發明專利]基于體外反應體系篩選黃曲霉SUMO化靶蛋白的方法

有效

• 申請號: 201710647254.6
• 申請日: 2017-08-01
• 公開（公告）號: CN107389945B
• 公開（公告）日: 2019-02-22
• 發明（設計）人: 聶鑫怡;李玲;岳躍威;汪世華
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C40B50/06
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種黃曲霉SUMO化酶系的體外反應體系，其特征在于：該體系由SUMO化反應溶液體系組成，其中包含了由修飾分子AfSumO、SUMO E1活化酶AfAosA及AfUbaB、SUMO E2結合酶AfUbcI、SUMO E3連接酶分別經過原核表達后得到的重組蛋白，以及待檢測的蛋白或藥物；

所述的原核表達的黃曲霉SUMO化酶系中的修飾分子AfSumO，其編碼序列選自：核苷酸編碼序列SEQ ID No. 1，蛋白序列SEQ ID No. 2；

所述的SUMO E1活化酶AfAosA及AfUbaB，其編碼序列選自：核苷酸序列SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4，分別對應的編碼蛋白序列SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6；

所述的SUMO E2結合酶AfUbcI，其編碼序列選自：核苷酸序列SEQ ID No. 7，其編碼的蛋白序列SEQ ID No. 8；

體系中的所選取的SUMO化酶系中的SUMO E3連接酶選自AfSizA，其編碼序列選自： 核苷酸編碼序列SEQ ID No. 9，其編碼的蛋白序列SEQ ID No. 10。

2.根據權利要求1所述的黃曲霉SUMO化酶系的體外反應體系，其特征在于：所述的SUMO化反應溶液體系含有如下成分：pH 7.0-7.4、10-100 mM HEPES，0-300 mM NaCl，5-20 mMMgCl₂，0-0.5 mM dithiothreitol，0-50μg/mL bovine serum albumin Fraction V，1-20mM ATP，0.1-50 μg/mL重組AfSumO，0.1-50 μg/mL重組AfAosA，0.1-50 μg/mL重組AfUbaB，0.1-50 μg/mL重組AfUbcI以及0.1-50 μg/mL重組SUMO E3連接酶。

3.根據權利要求1或2所述的黃曲霉SUMO化酶系的體外反應體系，其特征在于：體系中的所選取的酶組分，包括修飾分子AfSumO，SUMO E1活化酶AfAosA及AfUbaB，SUMO E2結合酶AfUbcI， SUMO E3連接酶，都是將其編碼序列克隆入原核表達載體進行原核表達，并利用載體上的親和標簽進行純化獲得的具備相應體內活性的高純度重組蛋白。

4.根據權利要求1所述的黃曲霉SUMO化酶系的體外反應體系，其特征在于：所述SUMO化體外反應條件如下：4-37℃下反應5至120min。

5.一種篩選SUMO化靶標蛋白的方法，其特征在于：基于權利要求1或2所述的黃曲霉SUMO化酶系的體外反應體系，并結合體外展示技術，在體外對潛在的SUMO化靶標進行不同通量的篩選及鑒定。

6.根據權利要求5中所述的一種篩選SUMO化靶標蛋白的方法，其特征在于：包括以下：

（1）不同通量的待檢測蛋白的表面展示文庫構建；

（2）表面展示文庫與SUMO化體外反應體系共同反應；

（3）利用SUMO化酶系中的修飾物SumO的親和標簽所對應的親和介質，對體外反應體系中的游離SumO和發生SUMO化修飾的蛋白及其偶聯的遺傳信息進行富集和多輪淘選；

（4）通過檢測篩選的SUMO化修飾的蛋白所偶聯的遺傳信息，鑒定潛在的SUMO化靶標蛋白。