[發明專利]一種高效檢測藍藻細胞周期的方法

有效

• 申請號: 201710646653.0
• 申請日: 2017-08-01
• 公開（公告）號: CN107287331B
• 公開（公告）日: 2020-06-26
• 發明（設計）人: 鄭正高;董春霞;趙進東
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12Q1/6897
• 分類號: C12Q1/6897;C12N15/74
• 代理公司: 北京萬象新悅知識產權代理有限公司 11360
• 代理人: 李稚婷

本發明公布了一種高效檢測藍藻細胞周期的方法，利用酰胺酶AmiC3或其同源蛋白和熒光蛋白的融合蛋白來標記藍藻細胞分裂環，通過觀測熒光顯示的藍藻細胞分裂環出現的狀態來判斷其細胞周期。本發明解決了目前藍藻不能很好的進行細胞周期檢測的技術問題，為研究藍藻細胞分裂與分化的聯系提供了一條途徑，也為通過檢測細胞周期來評定藍藻的生長狀態提供了一條便捷直觀的方法。

技術領域

本發明涉及細胞周期檢測方法，特別涉及一種高效檢測藍藻細胞周期的方法。

背景技術

高效檢測藍藻的細胞周期具有很重要意義。首先，藍藻作為一種最簡單的研究細胞分化的模式生物，通過活體檢測其每個細胞的分裂周期，并研究與之對應分化潛能，就為研究細胞的分裂與分化之間的相互關系提供了一條途徑。其次，藍藻由于其光合作用、易于基因操作、生長速度快等特點，在文獻上和工業發酵上有很多利用其作為生物反應器來表達外源基因的例子，比如產脂肪酸和纖維素等。高效檢測細胞周期可以評定藍藻的生長狀態，判斷藍藻處于生長的哪個時期，從而為藍藻發酵工業快速檢測藍藻生長狀態提供簡便的方法。

目前檢測藍藻細胞周期沒有太好的方法。藍藻是原核生物，其染色體數目不是固定的，是一種染色體數目與細胞體積相關的多倍體，所以用流式細胞儀不能很好檢測細胞周期。

發明內容

本發明的目的是提供一種高效活體檢測藍藻每個細胞所對應的分裂周期的方法，解決了目前藍藻不能很好的進行細胞周期檢測的技術問題，為研究藍藻細胞分裂與分化的聯系提供了一條途徑，也為通過檢測細胞周期來評定藍藻的生長狀態提供了一條便捷直觀的方法。

為實現上述目的，本發明利用酰胺酶AmiC3或其同源蛋白和熒光蛋白的融合蛋白來標記藍藻細胞分裂環，通過熒光顯微鏡觀測藍藻細胞分裂環出現的狀態來判斷其細胞周期，從而構建了一種高效活體檢測藍藻每個細胞所對應的分裂周期的方法。具體的，本發明的技術方案如下：

一種檢測藍藻細胞周期的方法，包括以下步驟：

1)構建含有啟動子驅動的amiC3基因或其同源基因-熒光蛋白基因的融合片段的整合載體；

2)通過基因重組技術將所述啟動子驅動的amiC3基因或其同源基因-熒光蛋白基因的融合片段整合到藍藻的基因組中；

3)通過熒光顯微鏡觀測每個細胞的熒光顯示的細胞分裂環狀態，判斷細胞對應的分裂周期。

上述方法中，所述amiC3基因編碼一種能水解細菌肽聚糖層的酰胺酶AmiC3，其定位在周質空間的分裂環上。amiC3基因在魚腥藻Anabaena sp.PCC 7120的基因編號為all1140，編碼的蛋白為AmiC3，在其他藍藻內也存在AmiC3對應的同源蛋白基因，例如魚腥藻Anabaena variabilis ATCC 29413中的Ava_4396，基因核苷酸序列同源性達98.1％，所編碼的蛋白氨基酸序列同源性達96.5％；又如項圈藻Nostoc sp.PCC 7524中的Nos7524_2309，基因核苷酸序列同源性達92.0％，所編碼的蛋白氨基酸序列同源性達82.4％；又如眉藻Calothrix sp.PCC 6303中的Cal6303_3915，基因核苷酸序列同源性達86.3％，所編碼的蛋白氨基酸序列同源性達74.4％；又如費氏藻屬Fischerella sp.JSC-11中的FJSC11DRAFT_0937，基因核苷酸序列同源性達87.5％，所編碼的蛋白氨基酸序列同源性達73.5％。

所述熒光蛋白基因優選為綠色熒光蛋白基因gfp。amiC3基因或其同源基因-熒光蛋白基因的融合片段在啟動子的驅動下進行表達，所述啟動子優選為amiC3啟動子P_amiC3，也可以采用其他的組成型啟動子或誘導性啟動子，例如Cu²⁺濃度誘導型啟動子P_petE，藍細菌的強啟動子P_cpcBA等。