[發(fā)明專利]一種溶液中枸櫞酸含量的高通量測定方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710646028.6
• 申請日: 2017-08-01
• 公開（公告）號: CN107505276A
• 公開（公告）日: 2017-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 章登吉;楊云光;李杰;鄧小潔;常亞敏
• 申請（專利權(quán)）人: 上海美迪西生物醫(yī)藥股份有限公司;美迪西普亞醫(yī)藥科技（上海）有限公司
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33
• 代理公司: 上海瀚橋?qū)＠硎聞?wù)所(普通合伙)31261
• 代理人: 曹芳玲,熊子君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生化分析和醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，具體涉及一種溶液中枸櫞酸含量的高通量測定方法。

背景技術(shù)

枸緣酸又稱檸檬酸(H3cit)，是一種重要的有機酸，無色晶體，常含一分子結(jié)晶水，無臭，有很強的酸味，易溶于水。枸緣酸的用途非常廣泛，用于食品工業(yè)占生產(chǎn)量的75％以上，可作為食品的酸味劑、抗氧化劑、pH調(diào)節(jié)劑、用于清涼飲料、果醬、水果和糕點等食品中。用于醫(yī)藥工業(yè)占10％左右，主要用作抗凝血劑、解酸藥、矯味劑、化妝品等。用于化學(xué)工業(yè)等占15％左右，用作緩沖劑、絡(luò)合劑、金屬清洗劑、媒染劑、膠凝劑、調(diào)色劑等。在電子、紡織、石油、皮革、建筑、攝影、塑料、鑄造和陶瓷等工業(yè)領(lǐng)域中都有十分廣闊應(yīng)用價值。鑒于枸緣酸如此廣泛的應(yīng)用價值，則對于枸櫞酸的檢測為多個行業(yè)所需要。

醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，枸櫞酸又與人類的健康息息相關(guān)。如枸櫞酸及其鹽在泌尿系統(tǒng)結(jié)石的形成和預(yù)防中起著十分重要的作用。枸櫞酸，具有3個羧基和1個羥基，羧基之間的距離為3個C-C鍵長度，在溶液中，H3cit可與Ca²⁺離子形成含有1個五元環(huán)和1個六元環(huán)的螯合物，其穩(wěn)定常數(shù)為4.79×10⁴。H3cit及其鹽與尿液中Ca²⁺離子形成難以離解的高度可溶性枸櫞酸鈣后，可以隨尿液排出體外，從而降低尿鈣的濃度和尿中草酸鈣及磷酸鈣的飽和度。結(jié)石患者的尿液中，H3cit濃度降低，這使得其尿中離子鈣分數(shù)升高，CaO_Xa(草酸鈣)的過飽和度增大形成含鈣結(jié)石。研究表明，一些泌尿系統(tǒng)鈣鹽結(jié)石患者常有低枸櫞酸尿癥。因此檢測尿液中枸櫞酸含量對于結(jié)石病的診斷及一些治療結(jié)石病的藥物的療效評估都具有重要的價值。

目前24h尿生化指標中，無機離子的檢測較為簡單，而尿枸櫞酸則為有機酸，含量低，檢查難度較大，目前國內(nèi)外現(xiàn)有常用方法為比色法和滴定法，該兩種方法靈敏度低，難以對尿液樣品中微量的草酸、枸櫞酸進行準確的定量分析，且常用的變色酸比色法需用濃硫酸，化學(xué)比色法需用溴，對工作人員及環(huán)境均有影響，這兩種測量方法除操作復(fù)雜外，還得一個樣品、一個樣品的依次單個進行檢測，一次性檢測的通量有限。HPLC法測定樣品前，需對尿液進行預(yù)處理，需要加入濃鹽酸酸化旨在防止維生素C等在中性或堿性環(huán)境下轉(zhuǎn)化為草酸而影響測定結(jié)果，還要加入磺基水楊酸可除去尿樣中少量的蛋白，減少雜峰的干擾，樣品的預(yù)處理過程復(fù)雜繁瑣，而且濃鹽酸的添加需要在通風(fēng)廚等特定設(shè)施里操作，否則易揮發(fā)刺激人體影響環(huán)境(HPLC法同時測定尿液中草酸和枸櫞酸含量的方法學(xué)評價及臨床應(yīng)用)。市場上雖有試劑盒基于酶解反應(yīng)再逐個測定反應(yīng)紫外吸光光度值，然而該試劑盒需要借助于比色皿，比色皿檢測不僅樣品的消耗量都很大，不經(jīng)濟，費用昂貴，而且還是要利用公式逐個計算樣品結(jié)果的方法對枸櫞酸進行檢測，操作耗時不便，效率也低。總之，上述這些現(xiàn)有的枸櫞酸檢測方法存在著一定的不足，在醫(yī)學(xué)和生化檢驗方面應(yīng)用起來缺乏便利性，實際操作難度大。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種更為便利、高效率、經(jīng)濟省樣本的溶液中枸櫞酸含量的檢測方法。

本發(fā)明提供一種溶液中枸櫞酸含量的高通量測定方法，包括以下步驟：

(1)配制不同濃度梯度的枸櫞酸標準品；

(2)配制含有L-蘋果酸脫氫酶、L-乳酸脫氫酶和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的酶解反應(yīng)液A液；

(3)配制含有枸櫞酸裂解酶的酶解反應(yīng)液B液；

(4)在多孔紫外微孔板的各孔中加入所述酶解反應(yīng)液A液；

(5)向所述多孔紫外微孔板的各孔分別加入枸櫞酸標準品和一個以上的待測樣品，反應(yīng)一段時間后，置于酶標儀上在特定紫外波長下讀取各枸櫞酸標準品微孔的吸光度值A(chǔ)_STD1、以及待測樣品微孔的吸光度值A(chǔ)_SP1；

(6)在所述多孔紫外微孔板的各孔中再加入酶解反應(yīng)液B液，反應(yīng)一段時間后，置于酶標儀上在所述特定紫外波長下讀取各枸櫞酸標準品微孔的吸光度值A(chǔ)_STD2、以及待測樣品微孔的吸光度值A(chǔ)_SP2；

(7)將各枸櫞酸標準品微孔的A_STD1和A_STD2的差值ΔA與各枸櫞酸標準品的濃度進行回歸擬合來構(gòu)建標準曲線；

(8)將A_SP1和A_SP2的差值插入所述標準曲線，得到對應(yīng)的濃度，即可得到待測樣品的枸櫞酸含量。