[發(fā)明專(zhuān)利]一種溶液中枸櫞酸含量的高通量測(cè)定方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710646028.6
• 申請(qǐng)日: 2017-08-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107505276A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 章登吉;楊云光;李杰;鄧小潔;常亞敏
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海美迪西生物醫(yī)藥股份有限公司;美迪西普亞醫(yī)藥科技（上海）有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N21/33
• 分類(lèi)號(hào): G01N21/33
• 代理公司: 上海瀚橋?qū)＠硎聞?wù)所(普通合伙)31261
• 代理人: 曹芳玲,熊子君

1.一種溶液中枸櫞酸含量的高通量測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）配制不同濃度梯度的枸櫞酸標(biāo)準(zhǔn)品；

（2）配制含有L-蘋(píng)果酸脫氫酶、L-乳酸脫氫酶和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的酶解反應(yīng)液A液；

（3）配制含有枸櫞酸裂解酶的酶解反應(yīng)液B液；

（4）在多孔紫外微孔板的各孔中加入所述酶解反應(yīng)液A液；

（5）向所述多孔紫外微孔板的各孔分別加入枸櫞酸標(biāo)準(zhǔn)品和一個(gè)以上的待測(cè)樣品，反應(yīng)一段時(shí)間后，置于酶標(biāo)儀上在特定紫外波長(zhǎng)下讀取各枸櫞酸標(biāo)準(zhǔn)品微孔的吸光度值A(chǔ)_STD1、以及待測(cè)樣品微孔的吸光度值A(chǔ)_SP1；

（6）在所述多孔紫外微孔板的各孔中再加入酶解反應(yīng)液B液，反應(yīng)一段時(shí)間后，置于酶標(biāo)儀上在所述特定紫外波長(zhǎng)下讀取各枸櫞酸標(biāo)準(zhǔn)品微孔的吸光度值A(chǔ)_STD2、以及待測(cè)樣品微孔的吸光度值A(chǔ)_SP2；

（7）將各枸櫞酸標(biāo)準(zhǔn)品微孔的A_STD1和A_STD2的差值ΔA與各枸櫞酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度進(jìn)行回歸擬合來(lái)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線；

（8）將A_SP1和A_SP2的差值插入所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到對(duì)應(yīng)的濃度，即可得到待測(cè)樣品的枸櫞酸含量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟（1）中，配制濃度范圍為50000～1000ng/mL的枸櫞酸標(biāo)準(zhǔn)品5個(gè)以上，優(yōu)選地，配制濃度分別為40300、32240、24180、16120、8060、4030、2015、1007.5ng/mL的枸櫞酸標(biāo)準(zhǔn)品以構(gòu)建定量用標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測(cè)定方法，其特征在于，

待測(cè)溶液是尿液、果汁、酒、固體食品的溶液中的任意一種，優(yōu)選地，所述待測(cè)溶液是尿液，所述待測(cè)樣品是將待測(cè)尿液用水稀釋而得，優(yōu)選地，至少稀釋10倍；

待測(cè)溶液的枸櫞酸含量由步驟（8）中所得的濃度乘以稀釋倍數(shù)而得。

4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟（2）中，酶解反應(yīng)液A液中，溶劑為甘氨酰甘氨酸緩沖液，L-蘋(píng)果酸脫氫酶的濃度為10～15U/mL，L-乳酸脫氫酶的濃度為20～30 U/mL，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的濃度為0.3～0.6g/L。

5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟（3）中，酶解反應(yīng)液B液中，溶劑為水，優(yōu)選為雙蒸水，枸櫞酸裂解酶的濃度為30～50U/mL。

6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征在于，

所述多孔紫外微孔板是96孔紫外微孔板，

步驟（4）中，酶解反應(yīng)液A液的用量為100微升/孔以下；

步驟（5）中，枸櫞酸標(biāo)準(zhǔn)品和/或待測(cè)樣品的用量為200微升/孔以下；

步驟（6）中，酶解反應(yīng)液B液的用量為2微升/孔以下。

7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟（5）中，待測(cè)樣品的數(shù)量為30個(gè)以上。

8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述特定紫外波長(zhǎng)為320～360nm，優(yōu)選為340nm。

9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟（5）和/或步驟（6）中，反應(yīng)時(shí)間為5分鐘以上。

10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟（7）和步驟（8）采用微孔板數(shù)據(jù)采集和分析軟件進(jìn)行，所述軟件優(yōu)選為SoftMax軟件。