[發明專利]啟動子pYLG及其在構建高產長鏈二元酸的熱帶假絲酵母中的應用

有效

• 申請號: 201710645497.6
• 申請日: 2017-08-01
• 公開（公告）號: CN107384923B
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 汪俊卿;修翔;彭健;王瑞明;薛樂;王騰飛;蘇靜;楊曉慧
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/81;C12N15/65;C12N1/19;C12R1/74
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

1.啟動子pYLG在構建高產長鏈二元酸的熱帶假絲酵母中的應用，其特征在于，步驟如下：

（1）PCR擴增制備核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的啟動子pYLG片段；

（2）制備核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的甘油激酶GK片段；

（3）將步驟（1）制得的啟動子pYLG片段與步驟（2）制得的甘油激酶GK片段進行PCR重疊連接，制得pYLG-GK片段；

（4）以含有Kanr9k質粒的大腸桿菌為模板，進行PCR擴增，得到抗性基因Kanr片段；所述PCR擴增的引物核苷酸序列如下：

Kanr-up:5’-GACCTTCGTTTGTGCGGATCCTGAGGGAGCCACGGTTGAT-3’，

Kanr-down:5’-GAAAAGGGGGACGAGGATCGGTTGAGGCCGTTGAGCAC-3’

（5）將步驟（4）得到的抗性基因Kanr片段通過一步法定向克隆無縫克隆連接至pPICzαA載體，制得重組載體pPICzαA-Kanr；

（6）將步驟（3）制得的pYLG-GK片段通過一步法定向克隆無縫克隆連接至步驟（5）制得的的重組載體pPICzαA-Kanr，制得重組載體pPICzαA-Kanr-pYLG-GK；

（7）將步驟（6）制得的重組載體pPICzαA-Kanr-pYLG-GK經電擊轉化至熱帶假絲酵母，篩選陽性菌株，制得高產長鏈二元酸的熱帶假絲酵母。

2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述步驟（1）中，PCR擴增引物序列如下：

pYLG-up:5’-TTAGACCACTCTTTTGAGCTCGGTTGAAATGAATCGGCCG-3’，

pYLG-down:5’-ACTACGACGTGGCATTGTTGATGTGTGTTTAATTCAAGAATG-3’，

PCR擴增反應體系如下，總體系為50μl ：

2×HiFi-PCR Master 25μl，10μmol/L濃度的pYLG-up上游引物2μl，10μmol/L濃度的pYLG-down下游引物2μl，解脂耶氏酵母基因組DNA 2μl，ddH₂O補足50μl；

PCR反應程序如下：

95℃預變性5min； 95℃變性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸2min，30個循環；72℃延伸10min；-20℃保存。

3.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述步驟（2）中，PCR擴增引物序列如下：

GK-up:5’-AATTAAATTTTAACAATGCCACGTCGTAGTAGTAA-3’，

GK-down:5’-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAGCTTTATTTTTTTTTGTTCATTAGTTCTAC-3’；

PCR擴增反應體系如下，總體系為50μl ：

2×HiFi-PCR Master 25μl，10μmol/L濃度的GK-up上游引物2μl，10μmol/L濃度的GK-down下游引物2μl，熱帶假絲酵母基因組DNA 2μl， ddH₂O補足50μl；

PCR反應程序如下：

95℃預變性5min； 95℃變性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸4min，30個循環；72℃延伸10min；-20℃保存。