[發明專利]環介導等溫擴增結合側向流動試紙條法檢測鯉春病毒血癥病毒

在審

• 申請號: 201710645410.5
• 申請日: 2017-08-01
• 公開（公告）號: CN107267668A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 肖勤;劉露;王建梅;李慧欣
• 申請（專利權）人: 北京科弘生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢,何葉喧

技術領域

本發明涉及病毒檢測技術領域，具體涉及一種環介導等溫擴增結合側向流動試紙條法檢測鯉春病毒血癥病毒。

背景技術

鯉春病毒血癥(Spring viraemia of carp，SVC)是一種以出血為主要臨床癥狀并伴有高度傳染性的急性流行病，其病原為鯉春病毒血癥病毒(Spring viraemia of carp virus，SVCV)。該病發病急、死亡率高，死亡率可高達90％，嚴重危害漁業生產，世界動物衛生組織OIE將其列為必須申報的重要疫病。2008年，農業部第1125號公告更是將該病列為“中華人民共和國進境動物一類傳染病”，也是唯一一個被列為一類傳染病的魚類疫病，因此成為魚類口岸檢疫的第一類檢疫對象。

SVCV病毒粒子長90nm～180nm，寬60nm～90nm，有類脂囊膜，核衣殼中空，螺旋狀對稱，直徑50nm。病毒基因組為單股、負鏈、不分節段的RNA，長約11019個核苷酸，主要包含5個基因:RNA聚合酶蛋白(RNA polymerase,L)、糖蛋白(Glycoprotein,G)、基質蛋白(Matrix protein,M)、磷蛋白(Phosphoprotein,P)和核蛋白(Nucleoprotein,N)。該病毒對酸、熱及脂溶劑敏感，pH值7～10時穩定，在13℃～22℃均可生長，最適生長溫度為17℃。

SVCV主要危害越冬以后的幼鯉和一齡以上的鯉魚，死亡率較高。感染途徑是以水體為媒介，通過鰓進入魚體，再通過糞、尿排出體外。外傷也是一個重要的傳播途徑。無癥狀的帶毒魚體能持續數周不斷地排出病毒，在低水溫時病毒能在被感染的鯉魚血液中保持11周之久，即呈現持續性的病毒血癥時期。鯉魚急性感染時，在臨床上表現為病魚無目的的漂游，體發黑，腹部腫大；皮膚和鰓滲血；消化道出血，可見腹水嚴重帶血，腸炎、心、腎、鰾有時連同肌肉也有出血癥狀；內臟水腫，肝部血管有血管炎及水腫，導致血管壞死，肝實質壞死。當病魚出現這種顯性感染時，其腎、脾、腮、腦中會含有大量病毒粒子。

目前，尚缺乏有效控制SVCV的藥物和方法。國際上通行的控制該病的有效措施是進行SVC的監測，及早發現并進行隔離或撲殺。該病的診斷主要依賴于實驗室的檢測，目前，SVCV的檢測方法包括細胞學診斷、免疫學診斷及分子生物學診斷三大類。細胞學診斷技術主要是利用細胞分離培養病毒和電鏡觀察。該類方法操作繁瑣，檢測周期長，靈敏度低。免疫學診斷技術主要包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)和免疫熒光方法。該類方法靈敏度較高，但對抗體要求也高，已有報道表明針對SVCV歐洲株制備的抗體不能用于檢測亞洲株。另外，該類方法操作也相對繁瑣，大量樣本檢測工作量巨大。因此，建立快速、簡便、靈敏的檢測方法是水產養殖業的迫切需要。

環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術是Notomi等于2000年報道的一種新型等溫核酸擴增方法(國際專利公開號WO00/28082)，針對靶基因的6個位點設計4條LAMP引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(BstDNA聚合酶)，在恒溫條件下快速、高效、高特異、高靈敏地擴增靶序列，適合于現場和實驗條件較簡單的實驗室進行快捷檢測。引入一對環狀引物的改進方法，進一步縮短了反應時間。

側向流動試紙條(Lateral flow dipstick，LFD)是一種新的檢測方法，反應中羥基熒光素FAM標記的探針與生物素標記的LAMP擴增產物特異性雜交，避免了瓊脂糖凝膠電泳或熒光染料染色肉眼觀察由非特異性擴增造成的假陽性，進一步提高了反應的特異性和靈敏度。LFD檢測無需特殊的設備，操作者只需取10μL反應產物滴到點樣孔內，之后于點樣處前端滴加100μL緩沖液，靜置3-5分鐘，肉眼觀察即可。且不需有毒試劑，操作簡便且更安全。LAMP-LFD結合技術的檢測結果可以直接肉眼觀察。LFD試紙條上具有質控帶和檢測帶，兩條帶均顯色表示檢測結果為陽性，只有質控帶顯色檢測帶不顯色表明檢測結果為陰性。LAMP-LFD結合方法安全、快捷、高效、高靈敏度，且無設備及技術限制，具有其他技術所無法替代的優勢。

發明內容

本發明的目的是提供一種環介導等溫擴增結合側向流動試紙條法檢測鯉春病毒血癥病毒。

本發明提供的一種檢測鯉春病毒血癥病毒的環介導等溫擴增成套引物，由上游外引物、下游外引物、上游內引物和下游內引物組成；

所述上游外引物為如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；