[發明專利]液相色譜質譜聯用直接檢測生物組織非均勻樣本中氨基酸的方法

有效

• 申請號: 201710639231.0
• 申請日: 2017-07-31
• 公開（公告）號: CN107192783B
• 公開（公告）日: 2019-10-15
• 發明（設計）人: 郭娜;范斌;雷燕;閆寒
• 申請（專利權）人: 中國中醫科學院醫學實驗中心
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京科石知識產權代理有限公司 11595
• 代理人: 朱春野;唐玉剛

1.液相色譜質譜聯用直接檢測生物組織非均勻樣本中氨基酸的方法，其特征在于，包括：

用提取液處理生物組織非均勻樣本；

氨基酸標準品配制；

所述生物組織非均勻樣本包括心肌組織、大腦皮層組織和海馬組織；

其中，所述提取液處理生物組織非均勻樣本具體包括：

(i)將生物組織用生理鹽水洗凈，擦干，剪碎并混勻；

(ii)稱重，加20-30％甲醇溶液勻漿，得勻漿液；

(iii)將勻漿液放入-80℃冰箱冷凍；

(iv)將冷凍的勻漿液4-6μL，按照提取液與勻漿液的體積比大于250：1，與提取液混合；

(v)加入內標氘代苯丙氨酸，渦旋混合，內標氘代苯丙氨酸在最終待測樣本溶液中的體積含量為0.5％；

(vi)12000rpm、4℃離心，取上清液，待測；

所述氨基酸標準品配制包括：

(a)心肌組織氨基酸檢測

對高半胱氨酸、L-2-氨基己二酸、酪氨酸，用含0.1％甲酸的水溶液分別配制為100μg·mL^-1、1mg·mL^-1、250μg·mL^-1的標準品母液；

對其余氨基酸，用超純水配制成1mg/mL的標準品母液；

用提取液稀釋標準品母液，配制成混合標準品；

(b)皮層組織氨基酸檢測

對高半胱氨酸、酪氨酸、葉酸，均用含0.1％甲酸的水溶液分別配制為100μg·mL^-1、250μg·mL^-1、100μg·mL^-1的標準品母液；

對其余氨基酸，加超純水分別配制成濃度為1mg·mL^-1的標準品母液；

用提取液稀釋標準品母液，配制混合標準品；

(c)海馬組織氨基酸檢測

對高半胱氨酸、L-2氨基己二酸，均用含0.1％甲酸的水溶液分別配制為100μg·mL^-1、1mg·mL^-1的標準品母液；

對其余氨基酸標準品，加超純水分別配制成濃度為1mg·mL^-1的標準品母液；

用提取液稀釋標準品母液，配制混合標準品；

所述的提取液包括：

乙腈，其濃度為85％；

緩沖液，由濃度為0.1％的甲酸和濃度為1.7mM的甲酸銨組成；

所述提取液的pH為4.32。

2.根據權利要求1所述的方法，還包括以下步驟：

a)對氨基酸標準品進行母子離子對、錐孔電壓和碰撞能量摸索；

b)液相色譜質譜聯用條件和質譜條件優化；

c)求得氨基酸標準曲線；

d)液相色譜質譜聯用檢測生物樣本中氨基酸含量。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的液相色譜質譜聯用條件包括：

Waters ACQUITY UPLC系統，包括四元泵溶劑系統，在線脫氣機和自動進樣器；

XEVO TQ-S檢測器，MassLynxTM V4.1質譜工作站軟件；

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide，規格：100mm×2.1mm，1.7μm；

流動相：A：乙腈，含1mmol·L^-1甲酸銨和0.2％甲酸，

B：超純水，含1mmol·L^-1甲酸銨和0.1％甲酸；

梯度洗脫：

流速：0.3mL·min^-1，柱溫：40℃，進樣量：5μL；

所述的質譜條件包括：

ESI離子源：正離子模式；毛細管電壓：0.4KV；去溶劑溫度：400℃；去溶劑氣流速：800L/Hr；錐孔氣流速：150L/hr；霧化氣壓力：7.0Bar；采用MRM方式進行采集。

4.一種用于權利要求1-3任一項所述液相色譜質譜聯用直接檢測生物組織非均勻樣本中氨基酸的方法的試劑包，包括如下組分：

乙腈，其濃度為85％；

緩沖液，所述緩沖液由濃度為0.1％的甲酸和濃度為1.7mM的甲酸銨組成；

所述提取液的pH為4.32。