[發(fā)明專利]一種細胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速檢測方法

在審

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• 申請日: 2017-07-28
• 公開（公告）號: CN107435069A
• 公開（公告）日: 2017-12-05
• 發(fā)明（設計）人: 盧燎勛;張黎琛;梁銀明;黃蓉;晁天柱;鄭前前;羅靜;谷妍蓉;袁鵬
• 申請（專利權）人: 新鄉(xiāng)醫(yī)學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司41119
• 代理人: 胡云飛

技術領域

本發(fā)明涉及一種細胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速檢測方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種最新的基因定點編輯技術，由于此系統(tǒng)操作簡便，使用成本低廉，而且對基因組特異性位點進行編輯的效率非常高，所以其在動物、植物和微生物等領域的應用越來越廣泛。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)對基因組DNA進行剪切以后，常在切割位點形成少數(shù)幾個堿基的缺失或是插入，不能通過普通的凝膠電泳直接檢測出這種變化造成的差異。常規(guī)的檢測方法有5種：直接測序法、PCR酶切檢測法、T7E1酶切檢測法、PAGE電泳檢測法、高分辨率溶解曲線檢測法(high-resolution melting(HRM)analysis)，其中直接測序法可以獲得關于突變體非常詳細的信息，但是其周期長，操作繁瑣，不能大規(guī)模應用；PCR酶切檢測法極度依賴切割位點附近是否有可用的酶切位點，適用范圍非常狹窄；T7E1酶切檢測法靈敏度不夠高，需要多個步驟進行操作，而且T7E1酶價格昂貴，不適合進行大規(guī)模篩選；PAGE電泳檢測法步驟繁瑣，試劑昂貴，費時費力；高分辨率溶解曲線檢測法僅僅只能檢測是否有突變，不能得到堿基插入或是缺失的具體數(shù)目；所以，以上這些方法都不能同時快速和準確的對突變體進行檢測。

公布號為CN105177126A的中國發(fā)明專利公開了一種快速檢測基因敲除小鼠的方法，采用熒光PCR技術結合標準分子量內參快速檢測小鼠的敲除基因，但僅使用密度較少的內參分子量，檢測結果不夠精確，而且其檢測對象僅局限于小鼠，也沒有將這一技術應用于細胞系基因敲除的檢測。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種細胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速檢測方法，該方法不需要抽提細胞的基因組DNA，即可快速檢測CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因敲除的細胞系是否發(fā)生了堿基改變，同時可以獲得堿基插入或是缺失的具體數(shù)目。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：

一種細胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速檢測方法，包括如下步驟：

1)針對目標基因設計特異性的打靶位點，構建CRISPR/Cas9載體后轉染細胞系，所述CRISPR/Cas9載體上帶有能夠被流式細胞儀識別檢測的熒光標記；

2)使用流式細胞儀對轉染細胞進行分選，獲得陽性單克隆細胞；

3)將陽性單克隆細胞擴大培養(yǎng)，取培養(yǎng)后的細胞采用裂解液直接裂解，獲得DNA溶液；

4)設計上下游引物，使得PCR擴增序列覆蓋打靶位點，對上游引物5‘端進行FAM熒光標記，用步驟3)中的DNA溶液作為模板，進行PCR擴增，獲得單克隆細胞PCR產物；

5)制作標準分子量內參DNA：所述標準分子量內參DNA使用ROX進行標記，片段大小分別為：79、90、105、131、151、182、201、254、279、306、337、362、402和425；

6)將甲酰胺、所述單克隆細胞PCR產物和所述標準分子量內參DNA混合，變性后置于測序儀上進行毛細管電泳，結果使用Genemapper軟件進行數(shù)據(jù)分析，直接獲得PCR產物的大小，與野生型對照的PCR產物大小進行比較后，得出堿基插入或缺失的具體數(shù)目。

本發(fā)明增加了分子量大小為279和402的2個標準分子量，更高的密度可以獲得更精確的定位結果。

步驟1)所述CRISPR/Cas9載體為在母載體pX458上插入目標sgRNA序列改造而成。

步驟1)中所述細胞系為RAW264.7、B16細胞系。

當步驟1)中所述目標基因為小鼠Vav2基因時，打靶位點為5‘-GGCCAAGTACTACCGCACCCTGG-3’和5‘-GTTAGAGATTCAGGAGACCGAGG-3’。

當步驟1)中所述目標基因為小鼠Vav1基因時，打靶位點為5‘-CTACGAGGACCTAATGCGCT TGG-3’和5‘-CGAGGACCTTTATGACTGCG TGG-3’。

步驟2)中將轉染后的細胞培養(yǎng)40-80h后，進行流式細胞儀分選。本發(fā)明將轉染后的細胞培養(yǎng)40-80h后，進行流式細胞儀分選，可以保證分選后的細胞具有最大的存活率和最高的基因編輯效率。

步驟3)取100-1000個細胞進行直接裂解。