[發(fā)明專利]一種細(xì)胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710633469.2
• 申請日: 2017-07-28
• 公開（公告）號: CN107435069A
• 公開（公告）日: 2017-12-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 盧燎勛;張黎琛;梁銀明;黃蓉;晁天柱;鄭前前;羅靜;谷妍蓉;袁鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 鄭州睿信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司41119
• 代理人: 胡云飛

1.一種細(xì)胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速檢測方法，其特征在于：包括如下步驟：

1)針對目標(biāo)基因設(shè)計特異性的打靶位點(diǎn)，構(gòu)建CRISPR/Cas9載體后轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，所述CRISPR/Cas9載體上帶有能夠被流式細(xì)胞儀識別檢測的熒光標(biāo)記；

2)使用流式細(xì)胞儀對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行分選，獲得陽性單克隆細(xì)胞；

3)將陽性單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，取培養(yǎng)后的細(xì)胞采用裂解液直接裂解，獲得DNA溶液；

4)設(shè)計上下游引物，使得PCR擴(kuò)增序列覆蓋打靶位點(diǎn)，對上游引物5‘端進(jìn)行FAM熒光標(biāo)記，用步驟3)中的DNA溶液作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得單克隆細(xì)胞PCR產(chǎn)物；

5)制作標(biāo)準(zhǔn)分子量內(nèi)參DNA：所述標(biāo)準(zhǔn)分子量內(nèi)參DNA使用ROX進(jìn)行標(biāo)記，片段大小分別為：79、90、105、131、151、182、201、254、279、306、337、362、402和425；

6)將甲酰胺、所述單克隆細(xì)胞PCR產(chǎn)物和所述標(biāo)準(zhǔn)分子量內(nèi)參DNA混合，變性后置于測序儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，結(jié)果使用Genemapper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，直接獲得PCR產(chǎn)物的大小，與野生型對照的PCR產(chǎn)物大小進(jìn)行比較后，得出堿基插入或缺失的具體數(shù)目。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速檢測方法，其特征在于：步驟1)所述CRISPR/Cas9載體為在骨架載體pX458上插入目標(biāo)sgRNA序列改造而成。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速檢測方法，其特征在于：步驟1)中所述細(xì)胞系為RAW264.7、B16細(xì)胞系。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速檢測方法，其特征在于：步驟2)中將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)40-80h后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分選。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速檢測方法，其特征在于：步驟3)中所述裂解液的配方為：100mmol/L KCl，20mmol/L Tris-HCl pH＝9.0，0.3％TritonX-100，1.0mg/mL proteinase K。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速檢測方法，其特征在于：步驟3)中所述裂解的具體操作為：于55℃孵育15min，然后于95℃孵育10min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速檢測方法，其特征在于：步驟5)中所述標(biāo)準(zhǔn)分子量內(nèi)參DNA：以pUC19質(zhì)粒DNA為模板，下述引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到；

ROX-R：5‘-AAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTC-3’；

79F：5‘-GCTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTG-3’；

90F：5‘-GCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAAC-3’；

105F：5‘-GCAAACTATTAACTGGCGAACTAC-3’；

131F：5‘-GCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGC-3’；

151F：5‘-GACGAGCGTGACACCACGATGCCT-3’；

182F：5‘-GGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACC-3’；

201F：5‘-GAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACC-3’；

254F：5‘-GATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACC-3’；

279F：5‘-ACTGCGGCCAACTTACTTCTGACA-3’；

306F：5‘-GTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACAC-3’；

337F：5‘-ACGGATGGCATGACAGTAAGAGAA-3’；

362F：5‘-CTCACCAGTCACAGAAAAGCATC-3’；

402F：5‘-GGTCGCCGCATACACTATTCTCAGA-3’；

425F：5‘-TGACGCCGGGCAAGAGCA-3’。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速檢測方法，其特征在于：步驟6)中將甲酰胺、所述單克隆細(xì)胞PCR產(chǎn)物和所述標(biāo)準(zhǔn)分子量內(nèi)參DNA以16-20:1:1的比例混合。