[發(fā)明專利]一種石斛N?連接糖組的MALDI?TOF分析方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710630807.7
• 申請日: 2017-07-28
• 公開（公告）號: CN107402272A
• 公開（公告）日: 2017-11-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓曉菲
• 申請（專利權(quán)）人: 大連大學
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/72
• 代理公司: 大連智高專利事務(wù)所(特殊普通合伙)21235
• 代理人: 祝詩洋

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于糖組學分析領(lǐng)域，涉及一種石斛N-連接糖組的分析方法，具體涉及MALDI-TOF分析石斛N-連接糖組的方法。

背景技術(shù)

石斛為我國傳統(tǒng)中藥材，其藥用價值為人們所共識。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，多糖是石斛屬植物的主要活性成分。然而，目前針對石斛活性成分的研究方法仍主要是“提取→分離→純化→結(jié)構(gòu)鑒定”的傳統(tǒng)方法，糖類活性成分的研究不系統(tǒng)，隨機性大、效率低下，至今尚未明確石斛活性糖成分的具體結(jié)構(gòu)。

根據(jù)基因組和蛋白質(zhì)組的定義，糖組應(yīng)該被定義為單一生物體中的整套聚糖系統(tǒng)。糖組學是繼基因組學和蛋白組學后的新興研究領(lǐng)域，它的研究結(jié)果直接關(guān)系到是否能夠闡明基因功能及細胞功能。不同生物體中的糖組，無法統(tǒng)一，更無法由基因組推測。對糖組的研究最合適的做法是將糖組分解為不同的小組，平林淳和笠井獻一的研究組迄今所著眼的是糖蛋白組，而且以線蟲的基因組為基礎(chǔ)。

目前糖組研究方法較少，糖蛋白為主的糖組學技術(shù)問題和發(fā)展趨勢主要集中于以下四大技術(shù)難點：a.糖蛋白分離的問題；b.糖蛋白的基因識別效率較低；c.糖鏈的結(jié)構(gòu)分析和共價鍵的確定仍然不是一件容易的工作；d.目前這些糖組研究方法幾乎是靜態(tài)的，而生物體的糖基化過程是動態(tài)的。

糖是組成生命體的四大類重要分子之一，糖蛋白質(zhì)是由糖鏈與肽鏈中的特定氨基酸殘基以糖苷鍵共價連接而成的蛋白質(zhì)。糖蛋白質(zhì)普遍存在于生物體內(nèi)，在很多生命過程中起著重要作用，如蛋白質(zhì)的折疊、細胞之間的相互識別等。同時，糖基化修飾對植物品質(zhì)的鑒定、活性成分的發(fā)現(xiàn)和解析都具有重要意義。以基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜和電噴霧質(zhì)譜為代表的生物質(zhì)譜技術(shù)，因具有快速、靈敏、可提供結(jié)構(gòu)信息等優(yōu)點，有望成為糖蛋白質(zhì)組和糖組分析的重要工具。

高靈敏地鑒定生物體內(nèi)的N-糖鏈是研究其結(jié)構(gòu)和組成的首要前提。然而，N-糖鏈研究面臨著以下困難：首先，糖基化修飾的蛋白質(zhì)種類眾多、但含量較低；其次，N-糖鏈在質(zhì)譜中的離子化效率較低，難以被質(zhì)譜鑒定；再次，N-糖鏈圍觀結(jié)構(gòu)不均一導致糖鏈在質(zhì)譜中信號分散和減弱，難以被質(zhì)譜鑒定；最后，N-糖鏈的富集困難，選擇性差。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有技術(shù)中石斛N-連接糖組學研究的不足，本發(fā)明建立了石斛N-連接糖組的MALDI-TOF分析方法，通過該方法解析出超過32種的石斛N-連接糖類型，為石斛活性成分的發(fā)現(xiàn)和石斛品質(zhì)的鑒定提供了有效的檢測手段。

一方面，本發(fā)明提供一種石斛N-連接糖組的MALDI-TOF分析方法，包括以下步驟：

(1)鐵皮石斛糖蛋白的提?。?!-- SIPO -->

(2)用PNGase F從糖蛋白上切下糖鏈；

(3)糖鏈的衍生；

(4)固相萃?。?/p>

(5)MALDI-TOF對糖鏈進行質(zhì)譜解析。

本發(fā)明所述的石斛N-連接糖組MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步驟(1)包括取石斛原料粉碎，加入10倍干重的雙蒸水，勻漿，70℃浸提12h，離心取上清；沉淀加入10倍干重的雙蒸水重復浸提，合并兩次浸提的上清即為石斛糖蛋白；將石斛糖蛋白采用sevage法去除游離蛋白，加入無水乙醇至終濃度70％醇析沉淀糖蛋白。

本發(fā)明所述的石斛N-連接糖組MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步驟(2)包括將石斛糖蛋白上清液10kDa濾膜超濾，取截留液加入0.5％SDS的緩沖液和50mM DTT的變性緩沖液，56℃變性15min；將變性后糖蛋白加入50mM磷酸鹽緩沖液配制的PNGase F中，37℃孵育12h，10KDa濾膜超濾，取透過液，得含游離糖的PNGase F酶解液。

本發(fā)明所述的石斛N-連接糖組MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步驟(3)包括向步驟(2)獲得的含游離糖的PNGase F酶解液中加入17氟癸胺對糖鏈進行修飾衍生，在糖鏈分子中引入氟。

所述17氟癸胺的結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明所述的石斛N-連接糖組MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步驟(4)包括將步驟(3)獲得的產(chǎn)物過氟固相萃取柱，富集含有氟標簽的糖鏈，氮氣吹干除去溶劑，再以20μL 50％的甲醇/水溶液復溶。

本發(fā)明所述的石斛N-連接糖組MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步驟(5)包括取步驟(4)獲得的產(chǎn)物4μL點樣于靶板上，真空抽干，再加含10mg/mL DHB和1mM NaAc的溶液2μL，真空抽干，使用MALDI-TOF質(zhì)譜儀用陽離子模式進行質(zhì)譜檢測。