[發明專利]一種石斛N?連接糖組的MALDI?TOF分析方法

在審

• 申請號: 201710630807.7
• 申請日: 2017-07-28
• 公開（公告）號: CN107402272A
• 公開（公告）日: 2017-11-28
• 發明（設計）人: 韓曉菲
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/72
• 代理公司: 大連智高專利事務所(特殊普通合伙)21235
• 代理人: 祝詩洋

1.一種石斛N-連接糖組的MALDI-TOF分析方法，包括以下步驟：

(1)鐵皮石斛糖蛋白的提??；

(2)用PNGase F從糖蛋白上切下糖鏈；

(3)糖鏈的衍生；

(4)固相萃?。?/p>

(5)MALDI-TOF對糖鏈進行質譜解析。

2.如權利要求1所述的石斛N-連接糖組MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步驟(1)包括取石斛原料粉碎，加入10倍干重的雙蒸水，勻漿，浸提12h，離心取上清；沉淀加入10倍干重的雙蒸水重復浸提，合并兩次浸提的上清即為石斛糖蛋白。

3.如權利要求1所述的石斛N-連接糖組MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步驟(2)包括以10KDa濾膜超濾，加入0.5％SDS的緩沖液和50mM DTT的變性緩沖液，56℃變性15min；將變性后糖蛋白加入50mM磷酸鹽緩沖液配制的PNGase F中，37℃孵育12h，得含游離糖的PNGase F酶解液。

4.如權利要求1所述的石斛N-連接糖組MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步驟(3)包括向步驟(2)獲得的含游離糖的PNGase F酶解液中加入17氟癸胺對糖鏈進行修飾衍生，在糖鏈分子中引入氟。

5.如權利要求1所述的石斛N-連接糖組MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步驟(4)包括將步驟(3)獲得的產物過氟固相萃取柱，富集含有氟標簽的糖鏈，氮氣吹干除去溶劑，再以20μL 50％的甲醇/水溶液復溶。

6.如權利要求1所述的石斛N-連接糖組MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步驟(5)包括取步驟(4)獲得的產物4μL點樣于靶板上，真空抽干，再加含10mg/mL DHB和1mM NaAc的溶液2μL，真空抽干，使用MALDI-TOF質譜儀用陽離子模式進行質譜檢測。

7.如權利要求6所述的石斛N-連接糖組MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步驟(5)中質譜參數如下：離子源1:7.5kV；離子源2：6.75kV；反射電壓1:29.5kV，反射電壓2:13.95kV；激發光源為337nm，質荷比范圍為500-2000。

8.如權利要求1-7所述石斛N-連接糖組MALDI-TOF分析方法，其中所述的石斛為鐵皮石斛、霍山石斛。

9.如權利要求1-7所述石斛N-連接糖組的MALDI-TOF分析方法在獲得石斛蛋白糖組圖譜中的應用。

10.如權利要求1-7所述石斛N-連接糖組的MALDI-TOF分析方法在鑒定石斛真偽中的用途，包括將待測樣本的糖組圖譜與石斛標準品糖組圖譜進行對比。