[發(fā)明專利]促進(jìn)羅漢果CYP87D17基因表達(dá)的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710629512.8
• 申請日: 2017-07-28
• 公開（公告）號: CN107306792A
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 聶天軍;韋榮昌
• 申請（專利權(quán)）人: 聶天軍
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01H1/02;A01G1/00;A01G7/04;A01G7/06;A01N45/00;A01N43/08;A01N31/04;A01P21/00
• 代理公司: 北京遠(yuǎn)大卓悅知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11369
• 代理人: 靳浩

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種促進(jìn)羅漢果CYP87D17基因表達(dá)的方法。

背景技術(shù)

羅漢果甜苷V屬于葫蘆烷型四環(huán)三萜類物質(zhì)，本課題組前期根據(jù)羅漢果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，已推導(dǎo)出甜苷V可能的生物合成途徑。羅漢果甜苷V生物合成的前體物質(zhì)是異戊烯二磷酸(IPP)和3,3-二甲基烯內(nèi)基焦磷酸(DMAPP)，二者是通過甲羥戊酸(MVA)和甲基赤蘚糖醇磷酸化(MEP)兩條途徑形成，MVA途徑發(fā)生在胞質(zhì)中，MEP途徑發(fā)生在質(zhì)體中。來源于上述兩途徑的IPP或DMAPP經(jīng)牻牛兒基焦磷酸合酶(GPS)催化形成牻牛兒基焦磷酸(GPP)，IPP與GPP在法呢基焦磷酸合酶(FPS)的催化作用下進(jìn)而形成法呢基焦磷酸(FPP)，然后經(jīng)角鯊烯合酶(SS)、角鯊烯環(huán)氧化酶(SE)的催化形成2,3-氧化角鯊烯，葫蘆二烯醇合酶(CS)進(jìn)一步催化形成葫蘆二烯醇，最后在CYP450酶和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，形成羅漢果甜苷V。

異戊二烯類物質(zhì)的產(chǎn)生受到限速酶活性的嚴(yán)格調(diào)控，一直被認(rèn)為在其生物合成途徑中起著重要的調(diào)控作用。作為異戊二烯途徑中的限速酶，CYP450酶基因的表達(dá)對羅漢果甜苷V的生物合成起著決定性作用。過表達(dá)CYP450酶基因，可以促進(jìn)羅漢果甜苷V的積累；相反，如果抑制CYP450酶基因的表達(dá)，羅漢果甜苷V的產(chǎn)量將顯著降低。然而，CYP450酶基因是個超基因家族，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CYP87D17與羅漢果甜苷V的合成途徑有一定關(guān)聯(lián)。現(xiàn)有技術(shù)中未見有促進(jìn)羅漢果CYP87D17基因表達(dá)來提高羅漢果中甜苷V含量的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種通過茉莉酸甲酯處理羅漢果組培苗或其果實來促進(jìn)羅漢果CYP87D17基因表達(dá)的方法，為有效促進(jìn)羅漢果中甜苷V含量積累奠定基石。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種通過對羅漢果組培苗根系處理與花粉處理進(jìn)一步促進(jìn)羅漢果CYP87D17基因表達(dá)來提高羅漢果甜苷V含量的方法。

為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種促進(jìn)羅漢果CYP87D17基因表達(dá)的方法，將羅漢果組培苗接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)至少30天，其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中茉莉酸甲酯的濃度為50-400μmol/L。

優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果CYP87D17基因表達(dá)的方法，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其配方為：MS+1.5mg/L 6-BA+0.3mg/L IBA+3.5g/L瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/L活性炭。

優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果CYP87D17基因表達(dá)的方法，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：相對濕度60-66％、光照強度1400lux、光照時間8h/d、溫度23±2℃。

優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果CYP87D17基因表達(dá)的方法，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制方法如下：將茉莉酸甲酯溶解于體積分?jǐn)?shù)為2％的乙醇水溶液，配制成10000μmol/L的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯濃度為50-400μmol/L，滅菌并冷卻至24-26℃。

優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果CYP87D17基因表達(dá)的方法，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中茉莉酸甲酯的濃度為150-200μmol/L。

優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果CYP87D17基因表達(dá)的方法，將經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的羅漢果組培苗移栽后，待授粉后20-30天，每天早、中、晚于羅漢果表面噴灑誘導(dǎo)液至表面滴水，連續(xù)噴灑5天，所述誘導(dǎo)液中含有濃度為50-400μmol/L的茉莉酸甲酯。

優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果CYP87D17基因表達(dá)的方法，所述誘導(dǎo)液中含有濃度為100-150μmol/L的茉莉酸甲酯。

優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果CYP87D17基因表達(dá)的方法，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還包括有0.25mg/L油菜素甾醇和0.02mg/L獨角金內(nèi)酯。

優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果CYP87D17基因表達(dá)的方法，所述組培苗經(jīng)所述誘導(dǎo)培養(yǎng)之前經(jīng)過根部處理，所述根部處理具體包括：

將組培苗根系中根長小于最長根長度1/4的短根剪除，再將2-3條粗壯根用無菌刀分別劃2-3個傷口，傷口深度小于0.2mm，再用經(jīng)過預(yù)浸泡處理的玉米須包覆組培苗的根系，連續(xù)變溫處理10-12次，然后將組培苗上的玉米須去除，置于100-200高斯磁場中磁化處理1h；

每次變溫處理均為將根系包覆有玉米須的組培苗先置于2℃下貯存1min，再置于25℃下貯存5min；