[發明專利]用于擴增多個靶標的擴增子拯救多重聚合酶鏈式反應

有效

• 申請號: 201710627329.4
• 申請日: 2009-04-03
• 公開（公告）號: CN107385040B
• 公開（公告）日: 2022-02-15
• 發明（設計）人: 韓建
• 申請（專利權）人: 艾瑞普特公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12P19/34
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 張瑩

本發明公開了一種擴增和檢測多核苷酸的方法，該方法可以在相對短的時間內提供對來自臨床樣本的多種靶標的靈敏的、特異性的檢測。

本申請是國際申請號PCT/US2009/039552，國際申請日2009年4月3日，中國申請號200980118968.1，發明名稱為“用于擴增多個靶標的擴增子拯救多重聚合酶鏈式反應”的分案申請。

相關申請的交叉引用

本申請要求于2008年4月3日申請的美國臨時專利申請號61/042,259的優先權權益。

發明領域

本發明總體上涉及用于擴增核酸的方法。更具體地，本發明涉及用于使用聚合酶鏈式反應來擴增多種核酸序列的方法。

發明背景

聚合酶鏈式反應(PCR)的開發使得能夠使用DNA擴增用于多種應用，包括分子診斷測試。然而存在許多與PCR用于分子鑒別診斷(MDD)測定的應用相關的挑戰。PCR利用特異性的引物或引物組、溫度條件和酶。PCR反應可能容易被污染，引物結合對于不同的引物可能需要不同的條件，引物應該對于靶序列特異以便僅擴增該靶序列，等等。這使得其更難以從單個樣品中擴增多種序列。

過去，診斷測試臨床樣品以發現一種或多種疾病病原體需要分離和培養微生物。然而，這可能需要幾天，并且在許多情況下，如果要挽救患者的生命，診斷必須在幾小時內作出。分析單個臨床樣品以鑒定多種生物體從而確定哪一種或哪幾種可能是疾病的(多種)病原體是期望用于MMD的方法，并且已經開發了許多方法來較好地實現該目標。例如，已經開發了多重PCR法以擴增樣品內的多種核酸以便產生足夠的DNA/RNA從而能夠檢測和鑒定多種生物體。然而，多重PCR具有一些缺點。例如，多重PCR反應中的每種靶標需要其自己的最佳反應條件，因此增加靶標的數目需要每種單個靶標的反應條件不是最佳條件。此外，體系中的多組高濃度引物經常產生引物二聚體或獲得非特異性的本底擴增。這種特異性的缺乏也需要PCR后提純和多次雜交后洗滌的額外步驟。密集的引物由于需要利用酶和消耗底物而降低擴增效率。擴增效率的差異可能導致擴增子產量的顯著差異。例如，一些基因座可能非常有效地擴增，而另一些則擴增的效率很低或根本不能擴增。這種不均一擴增的可能性也使得難以至不可能準確地進行終點定量分析。

一種方法利用以非常低的濃度使用的嵌套式基因特異性引物以在初始PCR循環期間富集靶標。之后，使用共用引物來擴增所有靶標。整個反應在一個試管中進行，不需要額外輪次的PCR，并且不需要專門的儀器，但代替地，可以使用常規的熱循環儀來進行。然而，此方法有缺點。例如，因為使用低濃度的引物在初始循環期間富集靶標，因此測定的靈敏度最終降低，初始的富集循環的每次循環需要較長的退火時間，并且在經過擴增靶標所需的循環次數后酶很有可能變得不太有效。

對于更靈敏的、更快速的和更有效的用于擴增來自多種靶標的DNA和/或RNA以促進那些靶標的快速鑒定的方法仍然存在著需求。

發明概述

本發明涉及用于擴增核酸從而能夠檢測那些核酸的方法，該方法包括以下步驟：在第一次擴增反應中使用高濃度、靶標特異性引物擴增一種或多種靶核酸，從而產生至少一種含有至少一個共用引物結合位點的核酸擴增子；拯救所述至少一種核酸擴增子；以及在第二次擴增反應中使用與所述至少一個共用引物結合位點結合的共用引物擴增所述至少一種核酸擴增子。本發明的一個方面利用嵌套式靶標特異性引物。靶核酸可以包括DNA和/或RNA，并且可以包括病毒、細菌和/或真菌來源的DNA和/或RNA，以及人或其他動物來源的基因組DNA和/或RNA。擴增可以通過聚合酶鏈式反應(PCR)和/或RT-PCR進行。靶核酸的來源可以是來自一份或多份臨床、環境、或食品樣品，并且該方法可以以廣泛多樣的方式使用，包括，例如，臨床診斷、環境采樣、植物檢測、食品安全性分析、檢測遺傳病癥、和/或檢測疾病狀況。該方法可以用于人和/或獸的醫學診斷。