[發明專利]用于擴增多個靶標的擴增子拯救多重聚合酶鏈式反應

有效

• 申請號: 201710627329.4
• 申請日: 2009-04-03
• 公開（公告）號: CN107385040B
• 公開（公告）日: 2022-02-15
• 發明（設計）人: 韓建
• 申請（專利權）人: 艾瑞普特公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12P19/34
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 張瑩

1.一種多重PCR方法，包括

在第一次擴增反應中使用靶標特異性嵌套引物對擴增多種靶核酸，所述嵌套引物對包括針對每個靶核酸的正向-內側引物，正向-外側引物，反向-內側引物，反向-外側引物，其中嵌套引物的濃度是200-1000nM，并且其中所述正向-內側引物和反向-內側引物包括附加的核苷酸以提供對所述多種靶核酸不特異的附加序列，使得用此引物對靶核酸的擴增也會在所生成的擴增子中加入共用引物的結合位點，該共用引物與靶標特異性引物不同，其可以用來進一步擴增不相關的靶核酸擴增子，從而產生含有共用引物結合位點的核酸擴增子；

拯救所述核酸擴增子；以及

在第二次擴增反應中使用與所述共用引物結合位點結合的共用引物擴增所述核酸擴增子，

其中拯救是指將擴增子與第一次擴增的至少一部分引物分離，

其中所述靶標特異性嵌套引物選自由下列各項組成的組：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91和它們的組合。

2.如權利要求1所述的方法，其中所述靶核酸選自由病毒、細菌和真菌核酸組成的組。

3.如權利要求1所述的方法，其中所述靶核酸獲自人臨床樣品。

4.如權利要求1所述的方法，其中所述靶核酸獲自來自動物的臨床樣品。

5.如權利要求1所述的方法，其中所述共用引物選自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和其組合組成的組。

6.如權利要求1所述的方法，其中所述拯救所述核酸擴增子的步驟還包括從在第一反應體系中完成的擴增中取小樣品以提供用于在第二反應體系中第二次擴增的擴增子。

7.一種用于進行權利要求1-6中任一項所述方法的引物試劑盒，其中所述引物試劑盒包括SEQ ID Nos:1-2,SEQ ID NOs:3-6,8-11,13-16,18-21,23-26,28-31,33-36,38-41,43-46,48-51,53-56,58-61,63-66,68-71,73-76,78-81,83-86和88-91所示的引物和SEQID NOs:7,12,17,22,27,32,37,42,47,52,57,62,67,72,77,82,87和92所示的探針。